氩氦刀联合细胞过继免疫治疗非小细胞肺癌的临床观察

李娜 薄常文 邹长鹏 马文华 郑铮 安永辉

目前男性肺癌的发病率和病死率居所有恶性肿瘤首位，女性肺癌病死率也高居所有恶性肿瘤第二位［1］。由于肺癌的恶性程度较高，并且60%的患者在确诊时已属中晚期，失去手术机会而预后极差，发展中国家肺癌患者的5年生存率仅8.9%，寻找肺癌治疗的新策略成为研究的焦点［2］。氩氦刀属于微创手术，为失去手术机会或不愿手术的肺癌患者提供了一个有效治疗手段，它是利用超低温快速冷冻肿瘤细胞后迅速升温，从而引起肿瘤细胞包膜破坏，可迅速杀伤肿瘤细胞。该治疗对非小细胞肺癌具有创伤小、安全有效等特点。细胞生物治疗是以肿瘤免疫学为基础治疗模式，通过调动宿主的天然防卫机制或给予机体某些物质来取得抗肿瘤效应［3］，细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是一类抗肿瘤病毒的效应细胞，是一种对多重耐药肿瘤细胞敏感的广谱抗瘤免疫活性细胞［4］。CIK细胞可在体外被诱导并大量增殖，其中效应细胞、具有T淋巴细胞抗肿瘤活性，NK细胞为非MHC限制性细胞。本研究通过比较氩氦刀冷冻消融治疗及氩氦刀联合CIK细胞免疫治疗探讨其临床治疗的可行性和效果，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 所有患者为河北医科大学第一医院肿瘤科自2009年1月至2011年6月收治的经病理证实的非小细胞肺癌患者80例，随机分为治疗组和对照组，每组40例。治疗组:氩氦刀联合CIK治疗，其中男26例，女14例;平均年龄(67±9)岁，中位年龄67岁;病理分型:鳞癌13例，腺癌25例，其他2例;所有患者均采用国际抗癌联合会(UICC)第6版TNM分期，Ⅱ期6例，Ⅲa期14例，Ⅲb期16例，Ⅳ期4例。对照组:单纯氩氦刀组，男24例，女16例;平均年龄(67±10)岁，中位年龄67.5岁;病理分型:鳞癌15例，腺癌22例，其他3例;TNM分期:Ⅱ期8例，Ⅲa期17例，Ⅲb期10例，Ⅳ期5例。2组病例在年龄、性别比、病理分期、分型等方面有临床可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准:①年龄在18～75岁;②KPS评分≥60分;③预计生存期≥3个月;④无严重出血倾向，无急性感染，血常规、肝肾功能正常;⑤治疗前1个月及治疗后2周末行其他治疗;⑥经病理证实为非小细胞肺癌;⑦所有患者均签署知情同意书，能按照要求配合治疗。

1.2.2 排除标准:①年龄＜18岁或＞75岁;②未经病理证实;③孕妇或哺乳期女性;④精神、心理疾病不能配合治疗;⑤有颅内转移或合并其他脏器肿瘤;⑥严重心、肝、肾功能不全。

1.3 治疗方法

1.3.1 氩氦刀冷冻治疗:所有患者术前均行CT定位扫描，依据肺CT所显示的肿瘤与周围组织的三维立体解剖关系，制定手术计划，根据肿瘤大小，设计选择2、3、5 mm冷刀(美国Endocare公司)，单用或多刀组合，采用美国氩氦靶向冷冻手术系统(美国Endocare公司)、穿刺路径要避开肺内大血管、肋间神经、心包及主支气管。术中常规消毒、铺无菌巾后，用0.5%～1%利多卡因20～40 ml行局部浸润麻醉。麻醉成功后在CT引导下，将氩氦刀缓慢插入预先设计的肿瘤靶位，重新检查校对氩氦刀在瘤体内的位置、深度无误后，固定氩氦刀，如需多刀联合则将已插入的氩氦刀暂时冷冻固定，将剩余超导刀按之前方法逐一插入瘤体靶部位，再次检查核对无误后，同时启动超低温手术系统快速冷冻，冷冻30 s温度下降达-130℃左右，随着冷冻时间的延长，温度恒定在-145～-135℃，冷冻持续时间为15～20 min。冷冻结束后，开始启动氦气系统，当温度上升至10～15℃时，重新启动氩气超低温手术系统，实行第二次循环冷冻，冷冻时间同首次循环。冷冻结束后启动加热系统，温度上升至15～20℃时，氩氦刀超导探头可拔动时即可退刀。退刀后针道内填塞止血绫。手术后再次行CT扫描判断实际冷冻冰球范围是否与设计一致，同时观察有无出血及气胸。

1.3.2 CIK治疗:治疗组在氩氦刀手术前1～3 d行外周血采集:①CIK细胞培养:将分离的患者外周全血经Ficoll淋巴分离液梯度离心得到单个核细胞，分离后淋巴细胞加入IFN-γ 2 000 U/ml，24 h后加入IL-2 1 000 U/ml，CD3McAb 100 ng/ml，IL-1 10 U/ml，每3天换液1次，同时补加IL-2 500 U/ml。于细胞培养第9天检测CIK表面标记CD3、CD56、CD4、CD8，得到的细胞经台盼蓝染色检测细胞活力在90%以上，不含细菌和内毒素，方可治疗。②CIK细胞回输:将制备的CIK细胞悬液静脉输注，CIK细胞数(2～8)×108/次，1次/d，7 d为一个疗程，输注2个疗程后观察疗效。

1.4 T淋巴细胞亚群检测 对照组患者氩氦刀治疗前1 d及治疗后3 d，治疗组患者氩氦刀治疗前1 d及CIK细胞回输后3 d分别抽取外周血标本，采用流式细胞仪(美国Beckman Couter公司)分析外周血T细胞亚群CD+3、CD+4、CD+8数值及CD+4/CD+8比值变化。

1.5 肿瘤疗效评价指标(1)疗效评价:采用螺旋CT增强扫描，依据实体瘤疗效评价标准(RECIST)［5］进行疗效评价，完全缓解(CR):所有目标病灶动脉期增强显影均消失;部分缓解(PR):目标病灶(动脉期增强显影)的直径总和缩小＞30%;稳定(SD):缩小未达PR或增加未达PD;进展(PD):目标病灶(动脉期增强显影)的直径总和缩小＞20%或出现新病灶。临床有效率(RR)=(CR+PR)/总例数。(2)生活质量(QOL)评定:按karnofsky评分标准为指标，治疗后卡氏评分增加≥10分为QOL改善，增加＜10分为QOL稳定，KPS减少≥10分为QOL降低。(3)不良反应:药物毒性反应按照NCI CTC3.0标准评价，分为0～Ⅳ度。

1.6 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，计量资料以±s表示，计数资料比较采用χ2检验，采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组临床疗效比较 对照组RR与治疗组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 2组临床疗效比较n=40，例(%)

2.2 2组生活质量比较2组karnofsky评分均有明显提高，与治疗前比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。治疗后治疗组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 2组karnofsky评分比较n=40，±s

表2 2组karnofsky评分比较n=40，±s

注:与治疗前比较，*P＜0.05;与对照组比较，#P＜0.05

组别 对照组 治疗组治疗前67±571±7治疗后79±5*85±5*#

2.3 2组淋巴细胞亚群检测比较 治疗组在CD3、CD4、CD8、CD+4/CD8方面较治疗前比较均有明显改善(P＜0.05)，对照组在CD3、CD8、CD+4/CD+8较治疗前明显改善(P＜0.05)。治疗后治疗组与对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表3。

表3 2组淋巴细胞亚群检测比较n=40，±s

表3 2组淋巴细胞亚群检测比较n=40，±s

注:与治疗前比较，*P＜0.05;与对照组比较，#P＜0.05

组别CD+3 CD+4 CD+8 CD+4/CD+8对照组治疗前60.3±5.334.2±4.627±61.28±0.27治疗后67.3±2.4*35.6±3.722±5*1.81±0.62*治疗组治疗前60.0±4.936.2±4.824±51.4±0.52治疗后71.8±3.1*#51.7±2.7*#19±3*#3.8±0.59*#

2.4 不良反应发生情况比较 治疗组与对照组发生不良反应情况差异比较，无统计学意义(P＞0.05)。见表4。

表4 毒副反应发生情况比较n=40，例(%)

3 讨论

氩氦刀属于微创手术，为失去手术机会的肺癌患者提供了一个有效治疗手段。氩氦刀超低温冷冻治疗除了可以快速的杀死肿瘤细胞之外，还具有免疫调节作用。另外，超低温冷冻治疗肿瘤的免疫增强作用，能够激活T淋巴细胞增殖、激活T淋巴细胞的抗瘤活性，同时调控细胞因子分泌，由于细胞膜的破裂，肿瘤抗体升高，抗原释放，原位坏死组织可作为抗原，促进机体发生抗肿瘤免疫反应［6］。但是单纯的超低温冷冻治疗没有切除冷冻坏死组织，肿瘤吸收较缓慢。

肿瘤患者细胞免疫与肿瘤发生、发展关系密切，肺癌患者机体免疫功能处于抑制状态，Krant等［7］在1961年发现，肺癌患者循环血中淋巴细胞数目减少与患者的生存时间缩短密切相关。机体的免疫平衡依靠、维持、T细胞调节免疫活性，分泌细胞因子、T细胞有免疫抑制和细胞毒性作用。细胞因子激活的免疫活性细胞的过继免疫治疗是非特异免疫治疗的一种方法，Tian等［8］的研究认为，放化疗降低恶性肿瘤患者的免疫功能，CIK细胞治疗可以提高恶性肿瘤患者近期免疫功能、生活质量。CIK细胞(也称NK细胞)占外周血淋巴细胞中比例为1%～5%，在体外用细胞因子处理，在输入体内，能够激发全身性抗癌效应，肺内病灶缩小，症状改善。提高机体免疫机能，是一种有效的抗肿瘤免疫效应细胞，主要细胞成分为有抗癌活性和MHC限制性，作用于T细胞和T细胞，提高免疫力。化疗后2～4周输入CIK细胞，可提高肿瘤患者的缓解率，并在清除微小残留病灶方面发挥重要作用［9］。同时研究显示，CIK细胞治疗毒副作用较弱、抗肿瘤作用较强［10］。张效东等［11］报道DC-CIK细胞与分子靶向药物、微创技术等联合应用，显著提高了疗效，为肿瘤的综合治疗提供了新的方式。但是，对于CIK细胞联合氩氦刀治疗非小细胞肺癌临床试验较少，治疗作用效果尚需进一步的研究。

本组研究结果显示，单纯氩氦刀治疗与氩氦刀联合CIK细胞治疗非小细胞肺癌疗效相当(P＞0.05);治疗后两组组患者的KPS评分较治疗前均有明显的增加(P＜0.05)，氩氦刀联合CIK细胞治疗组的KPS评分明显高于单纯应用氩氦刀治疗组(P＜0.05)，说明在改善患者生活质量方面，氩氦刀联合CIK细胞治疗具有协同作用;2组淋巴细胞亚群检查显示，氩氦刀联合CIK细胞治疗组的CD+3、CD+4、CD+8、CD+4/CD+8也较单纯应用氩氦刀组有明显改善(P＜0.05)，说明氩氦刀联合CIK细胞治疗对免疫功能的影响具有协同作用，提示能够改善提高免疫功能;在不良反应发生情况来看，单纯氩氦刀组及氩氦刀联合CIK细胞治疗组，差异无统计学意义(P＞0.05)，2组不良反应均较轻，经对症处理后可较快缓解，无治疗相关性死亡。

以上分析提示，氩氦刀联合CIK细胞治疗非小细胞肺癌可协同杀伤肿瘤，能显著增强患者的免疫功能，改善患者生活质量，且能有效控制安全性，值得作为治疗非小细胞肺癌临床推广应用。

1 Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin，2011，61:69-90.

2 Ramalingam S，Belani C.Systemic chemotherapy for advanced nonsmall cell lung cancer:recent advances and future directions.Oncologist，2008，13:5-13.

3 张倩倩，李锦毅.DC与CIK抗肿瘤作用的研究进展.中国实用医药，2008，3:129-130.

4 Linn YC，Lau SK，Liu BH，et al.Characterization of the recognitionand functional heterogeneity exhibited by cytokine-induced killer cell subsets against acute myeloid leukaemia target cell.Immuology，2009，126:423-435.

5 杨学宁，吴一龙.实体瘤治疗疗效评价标准 -RECIST.循证医学，2004，4:85-90.

6 Pawelec G，Heizel S，Kiessling R，Escape mechanisms in tumor immunity:a year2000 update.Crit Rev Oncog，2000，11:97-133.

7 Krant MJ，Manskopf G，Brandrui CS，et al.Immunologic alteration in bronchogenic cancer.Cancer，1968，21:623-631.

8 Tian J，Teng DH.A clinical trial of cytokine in duced killer cells treating patient with manlignant tumor after radiochemotherapy.Chinese German Journal of Clinical，2010，9:656-659.

9 陈复兴，刘军权，张南征，等.自身细胞因子诱导的杀伤细胞过继性免疫治疗恶性肿瘤的临床观察.癌症，2002，17:187-188.

10 Kantoff PW，Schuetz TJ，Blumenstein BA，et al.Overall survival analysis of a phase II randomized controlled trial of a Poxviral-based PSA-targeted immunotherapy in metastatic castration-resistant prostate cancer.J Clin Oncol，2010，28:1099-1105.

11 张效东，周宁新，徐迎新，等.DC-CIK过继转移联合微创技术治疗消化道肿瘤.北京师范大学学报(自然科学版)，2010，46:489-491.