色素上皮衍生因子抑制糖尿病视网膜血管病变的研究新进展

李亚永，江新利(综述)，马会杰，刘 岩(审校)(1.河北医科大学第三医院内分泌科，河北 石家庄 050051；2.河北省石家庄市第一医院(西院)内科，河北 石家庄 050000；.河北医科大学第三医院眼科，河北 石家庄 050051；.河北医科大学基础医学院生理学教研室，河北 石家庄 050017)

·综述·

色素上皮衍生因子抑制糖尿病视网膜血管病变的研究新进展

李亚永1，2，江新利3(综述)，马会杰4，刘 岩1*(审校)
(1.河北医科大学第三医院内分泌科，河北 石家庄 050051；2.河北省石家庄市第一医院(西院)内科，河北 石家庄 050000；3.河北医科大学第三医院眼科，河北 石家庄 050051；4.河北医科大学基础医学院生理学教研室，河北 石家庄 050017)

糖尿病视网膜病变；色素上皮源性因子；信号传导

糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)是糖尿病最严重微血管并发症之一，其发病率、致盲率随着糖尿病病程的延长而增加。其基本病理改变包括早期血-视网膜屏障破坏、视网膜微血管瘤形成、出血、渗出，以及晚期新生血管形成和增殖性病变。色素上皮源性因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)是目前发现的最有效的内源性新生血管抑制因子，同时具有神经营养及神经保护功能。PEDF作为DR疾病发展过程的一个保护性因子，其作用机制一直是目前研究的热点。现就PEDF对DR保护作用研究的新进展以及分子生物学机制进行综述。

1 PEDF概述

1989年Tombran-Tink等[1]在胎儿视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium,RPE)培养液中首次提取一种具有促神经生长分化的细胞因子，即PEDF。PEDF相对分子质量为50 000，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂基因家族，但不具备蛋白酶抑制活性。人类PEDF基因位于染色体17p13，长度约为16kb，由8个外显子和7个内含子构成，具有高度保守性。

研究表明，PEDF具有神经营养、神经保护、抗肿瘤、抗新生血管以及改善血管通透性等多种作用。PEDF广泛存在于肿瘤、神经组织、肝、睾丸、卵巢、胎盘甚至毛囊中[2-3]，培养的内皮细胞、成骨细胞也可分泌PEDF[4]。在眼球中,RPE、角膜以及睫状上皮等多种细胞均可合成和分泌PEDF[5-6]。正常情况下眼球内PEDF的含量很低，玻璃体内PEDF浓度约为1～2mg/L，约为房水中PEDF的10倍，但为感光细胞间质中PEDF的1/10[7]。

2 PEDF在糖尿病视网膜病变中的作用

PEDF作为DR的一个保护性因子，其作用贯穿于DR病程的全过程，其作用如下。

2.1 抗氧化应激及改善血管通透性：DR的最早期病理改变为视网膜微血管周细胞丧失及功能障碍、血管通透性增加。糖尿病时持续高血糖状态导致体内多种蛋白质非酶糖基化并形成晚期糖基化终末产物(advanced glycation endproducts，AGEs)，AGEs可诱导还原型辅酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶活性，导致Akt激酶在Ser473的磷酸化，促使活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产生，并能减少视网膜血管内皮细胞钙黏蛋白(VE-cadherin)的表达，从而导致血管渗透性增加[7]。而PEDF可以减少NADPH膜亚基p22phox磷酸化，抑制NADPH氧化酶活性，从而减少AGEs诱导的ROS产生[8]，同时PEDF还可增加紧密连接蛋白(zona occludens-1,ZO-1)的表达，改善内皮细胞的屏障作用，从而抑制AGEs导致的血管通透性增加。但在糖尿病时，AGEs也抑制视网膜周细胞内PEDF mRNA的表达，造成PEDF生成减少，对视网膜病变的保护减少。Yoshida等[9]对链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的1型糖尿病大鼠的研究中发现，糖尿病大鼠视网膜PEDF水平下降，Müller细胞内胶质纤维酸性蛋白(gliad fibrilary acidicprotein,GFAP)表达增加，视网膜8-羟基脱氧鸟苷、p22phox和VEGF水平以及NADPH氧化酶活性增加，而这些变化可在静脉内注射PEDF4周后得以改善。

2.2 抗炎作用：慢性炎症反应在糖尿病视网膜病变的发生、发展中起着一定作用。有研究[10]发现，增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者玻璃体和STZ诱导的糖尿病大鼠视网膜的白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)含量增加，导致白细胞聚集、血管渗透性增加和内皮细胞形态改变。玻璃体内注射PEDF可以降低视网膜的一些促炎症因子，如单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)以及细胞间黏附因子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的含量[11]。反之，视网膜Müller细胞PEDF表达下降可以导致TNF-α分泌增多[12]。因此，PEDF可作为一种内源性抗炎症因子对糖尿病视网膜病变发挥保护作用。

2.3 PEDF抑制糖尿病视网膜新生血管形成：Dawson等[13]在1999年首次发现PEDF具有抑制血管增生的作用，这是维持角膜、玻璃体等组织无血管结构的主要原因。正常情况下，机体内血管生成促进因子和抑制因子之间保持平衡。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前已知的功能最强的新生血管形成促进因子，具有增加微血管通透性、促使内皮细胞外基质溶解、内皮细胞增殖移行及诱导血管生成等多种功能。正常情况下，在眼部视网膜的周细胞、视网膜色素上皮细胞和内皮细胞均可产生较低水平VEGF，这对维持眼部血管的完整是必要的，然而过度表达将促进血管的增殖。PEDF是目前发现的最强的抗新生血管因子。Ogata等[11]发现，DR患者玻璃体液中PEDF的含量较正常人明显减少，而作为促进血管增殖的VEGF则呈现相反的改变。Duh等[14]发现提高PEDF浓度能抑制小鼠视网膜新生血管形成。细胞培养亦证明,PEDF可抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖与迁移。糖尿病视网膜局部PEDF水平的减少则削弱了这种保护性作用，为DR发生创造条件或促使DR发生、发展及恶化。

目前的研究发现，PEDF对VEGF的抑制作用可能是通过以下几个信号途径实现的。

2.3.1 诱导细胞凋亡：Fas是TNF受体超家族成员，是一个跨膜受体，可与跨膜蛋白FasL结合，激活半胱氨酸蛋白酶(caspase)依赖的凋亡联级反应，从而导致细胞凋亡。FasL/Fas是最为常见的细胞凋亡途径。Volpert等[15]研究发现，PEDF的抗血管生成作用部分是通过FasL/Fas途径诱导内皮细胞凋亡实现的。静止期的血管内皮细胞FasL表达很低，且周围细胞抗凋亡蛋白如Bcl-2的浓度较高，从而阻止细胞凋亡的发生[16]。PEDF可以诱导内皮细胞FasL表达，导致细胞凋亡增加，从而抑制新生血管的形成。VEGF等新生血管刺激因子诱导产生的新生血管内皮细胞表达Fas受体，且易受PEDF作用而导致内皮细胞凋亡。Stellmach等[17]的研究发现，PEDF通过Fasl/Fas受体系统辨别新形成的血管内皮细胞和先前已存在的血管内皮细胞。可见，PEDF可特异性地抑制新生血管的增殖。此外，PEDF还可以通过激活人胞浆型磷脂酶A2(ytosolic phospholipase A2,cPLA2)、p38促分裂原活化蛋白(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)、脂质过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)以及p53等基因的表达诱导内皮细胞的凋亡[18]。

2.3.2 JAK2/STAT3途径:JAKs/STATs信号途径是人们在研究干扰素(interferon,IFN)-α、-γ研究中发现的，JAKs家族是一种非受体型酪氨酸蛋白激酶，有JAK1、JAK2、JAK3和TYK2等4个成员。STATs是JAKs激酶的底物，哺乳动物细胞STAT家族成员主要包括STAT1～6。JAKs激酶活化后导致胞浆中以单体存在的STATs分子磷酸化，形成二聚体，从而使其与受体解离，转移至核内并结合于启动子区相关序列，调控相关基因表达，导致血管内皮细胞增殖。研究[19-20]发现，VEGF为JAK2/STAT3信号途径的下游靶基因，多种促血管增殖因子都可以通过激活JAK2/STAT3进而增加VEGF表达。Zheng等[21]发现，高糖可以诱导牛视网膜毛细血管内皮细胞VEGF的表达增加以及JAK2/STAT3的磷酸化，而PEDF可以通过抑制JAK2/STAT3途径降低VEGF表达。

2.3.3 PI3K/Akt信号途径：PI3K/Akt信号通路是细胞内信号转导途径，在细胞的增殖、凋亡、转化以及肿瘤的发生中发挥重要作用。VEGF作为刺激因子可以导致PI3K的激活，PI3K被激活后，在细胞膜上生成第二信使PIPa，PIPa与细胞内含有PH结构域(pleckstrin homology domain)的信号蛋白Akt和磷酸肌醇依赖性蛋白激酶(phosphoinositide dependent kinase l，PDKl)结合，促使PDKl磷酸化Akt蛋白的Ser308，导致Akt的活化。有研究[22]发现，PI3K/Akt可能参与了高糖状态下内皮细胞迁移、增殖以及血管功能紊乱。PEDF可以有效地减弱VEGF介导的PI3K/Akt磷酸化，通过抑制PI3K/Akt信号途径抑制VEGF诱导的细胞迁移和体外RECs管形成[23]，从而抑制新生血管形成。

2.3.4 Src信号途径：Src家族激酶(The Src family of protein tyrosine kinases)由BLK、LYN、FYN、LCK、HCK、FGR、YRK、YES和c-Src9个成员组成。Src广泛存在于多种组织细胞中，参与丝裂原活化蛋白激酶信号途径、FAK通路、STATs通路、PI3K-Akt通路以及Na+-K+-ATP酶等多种信号途径的反应过程。Src被激活后可作为许多生化级联反应的关键点，将细胞外产生的信号传入胞内或者调控细胞内各分子间的信号传递，在细胞黏附、细胞增殖、调节血管生成的过程中发挥重要作用[24]。在VEGF诱导的血管生成过程中，Src激酶不仅可以保护血管内皮细胞免于凋亡，还参与了VEGF诱导的内皮细胞的迁移以及血管通透性增加过程[24]。同时，PEDF可通过Src途径抑制视网膜周细胞的凋亡。这些结果表明，PEDF可能通过Src依赖的途径抑制VEGF介导的血管通透性及视网膜血管内皮细胞的新生。

2.3.5 Wnt途径：Wnt信号途径是一种极其保守的细胞内信号转导途径，参与调节血管形成、炎症、纤维化等多种病理生理过程。Frizzled(Fz)家族是Wnt蛋白的膜上受体，与低密度脂蛋白受体相关蛋白(low density-lipoprotein receptor-related proteins 6,LRP6)形成Fz-LRP6二聚体，在Wnt信号途径中发挥重要作用。Park等[25]发现PEDF是一个新的Wnt信号途径的抑制因子，通过局部转基因使小鼠视网膜PEDF高表达和玻璃体注射PEDF蛋白都可以减弱视网膜缺血诱导的Wnt信号途径，而通过小干扰RNA(small interfering,siRNA)使PEDF表达降低和PEDF敲除均可以使Wnt信号途径激活。目前的研究认为，PEDF可以同LRP6结合，抑制Wnt诱导的Fz-LRP6二聚体的形成，从而抑制Wnt信号途径，进而阻断Wnt信号在DR病变中的作用。

3 PEDF生物制品在DR治疗中的应用

PEDF是抑制眼内新生血管生成的强有力因子，同时也是一种神经营养因子。因此，PEDF生物制剂为预防和治疗糖尿病视网膜病变提供了新的思路。但PEDF相对分子质量大、稳定性差、半衰期短，且全身应用PEDF制剂有可能干扰机体血管再生的整体调节，产生不良反应，故合成具有生物活性的PEDF多肽片段并局部应用是目前研究的重点。Longeras等[26]合成了具有34个氨基酸残基的PEDF片段(PED-34)，于体外实验发现PEDF-34可以抑制牛视网膜毛细血管内皮细胞增殖，诱导其凋亡。Liu等[27]构建了2种PEDF多肽P60和P78，将其作为眼药水治疗糖尿病模型小鼠，结果显示，虽然P60和P78可一定程度降低血管渗漏，并提高ZO-1蛋白的表达，但由于眼药水的靶向运输能力不足，治疗效果尚不令人满意。眼内PEDF转染在治疗眼血管增生模型上也取得了一定疗效。Campochiaro等[28]在治疗年龄相关性黄斑变性的临床试验中，将患者玻璃体内注射携带人PEDF基因的腺病毒载体，发现该载体具有长效抑制新生血管形成的作用。Kuo等[29]则将携带PEDF基因的质粒注射于大鼠结膜下，同样达到长效抑制新生血管形成的作用。但更为简单有效的治疗方法仍在进一步的研究中。

4 结 论

DR是一种严重的糖尿病微血管并发症，PEDF由于其抗炎、抗氧化以及强大的抑制病理性新生血管生成作用而在DR中备受关注，其内在机制以及相关的信号途径也随着相关研究的进展而日益更新，为DR的发病以及治疗提供了更多新的思路。

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(本文编辑：许卓文)

2013-12-23；

2014-03-06

河北省医学科学研究重点课题计划(20100356)

李亚永(1976-)，男，河北高邑人，河北省石家庄市第一医院主治医师，医学学士，从事内科临床和基础研究。

*通讯作者。E-mail:liuyanjiangcn@hotmail.com

R587.26

A

1007-3205(2014)11-1353-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.11.040