AMP活化蛋白激酶通路对骨重建影响的研究现状

高 柳，刘慧新(综述)，李玉坤(审校)(河北医科大学第三医院内分泌二科,河北省骨科生物力学重点实验室，河北 石家庄 050051)

·综述·

AMP活化蛋白激酶通路对骨重建影响的研究现状

高 柳，刘慧新(综述)，李玉坤*(审校)
(河北医科大学第三医院内分泌二科,河北省骨科生物力学重点实验室，河北 石家庄 050051)

AMP活化蛋白激酶类；骨重建；综述文献

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.044

骨重建是骨骼的自我更新过程，包括破骨细胞介导的骨吸收和成骨细胞介导的骨形成，两者失衡时可导致骨质疏松，因此研究骨重建过程对了解骨质疏松病变十分重要。1973年Berg和Carlson等首次发现腺嘌呤核糖核苷酸(adorosine monophosphate,AMP)活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，AMPK是蛋白激酶链中的关键激酶，可感应细胞能量代谢状态变化并经多种途径调节细胞能量平衡[1]，被称为真核细胞的“燃油量表”或“能量感受器”。AMPK可通过磷酸化多种代谢酶和调控基因转录与表达直接或间接影响骨代谢。因此，AMPK与骨重建的关系受到越来越多关注。现就AMPK对骨重建影响的近年研究进展综述如下。

1 AMPK的结构与调节

AMPK是进化高度保守的异源三聚体蛋白，由α催化亚基和β、γ调节亚基组成。哺乳动物有7种亚单位(α1，α2，β1，β2，γ1，γ2，γ3)，理论上可形成12种AMPK异源三聚体，其中α亚基氮端含有一个丝氨酸/苏氨酸激酶结构域，氮端激酶区的Thr-172残基磷酸化可激活AMPK，是测定AMPK活性的生物标志之一；β亚基含有与糖原结合的结构域，可感知组织中糖原状态；γ亚基包含一个多变氮端区域和与之连接的4种高保守硫胱醚重复序列，负责与AMP和ATP等腺苷酸结合[2]。

AMP为细胞低能量的信号分子，与γ亚基结合时使AMPK活性升高3～5倍[3]。当ATP缺乏时，AMP/ATP比值升高，AMPK开启产生ATP的分解代谢途径，同时关闭需要ATP的合成代谢途径和其他途径，这种作用维持胞内能量代谢平衡。迄今已发现3种AMPK上游激酶：肝激酶B1(liver kinase B1，LKB1)为发现最早的AMPK上游激酶，可磷酸化α亚基的Thr-172残基使AMPK活性增加100～1 000倍；钙调蛋白依赖性激酶激酶b(calmodulin-dependent kinase kinase b，CaMKKb)在胞内Ca2+浓度升高时激活，也可磷酸化α亚基的Thr-172残基；转化生长因子α活化激酶1(TGF-activated kinase 1,TAK1)，可在体或体外激活AMPK活性，尚不清楚TAK1激活AMPK的具体机制[4]。

2 AMPK与骨重建

AMPK在大多数亚型成骨细胞中表达，并组合为不同的复合物。Quinn等[5]检测了颅骨原代成骨细胞和Kusa O成骨样细胞以及体外培养的破骨样细胞、双电位巨噬细胞/破骨细胞系和RAW 264.7等巨噬细胞/破骨细胞系中的AMPK亚基，破骨细胞系表达α1、β1和γ1亚型，形成唯一的α1β1γ1异源三聚体；成骨细胞系表达α1、α2、β1、β2和γ1，可形成多种异源三聚体。但是Kasai等[6]发现在MC3T3-E1细胞和原代成骨细胞中检测不到AMPKα2、γ1、γ3亚基。此外，Shah等[7]对AMPK亚基mRNA在ROS17/2.8成骨样细胞和小鼠胫骨中的表达进行检测，结果显示骨细胞和组织表达α1、β1、β2、γ1、γ2和γ3亚型，未检出α2亚基。以上研究说明α1亚单位是骨组织表达的主要催化亚基，可能在骨骼代谢中发挥着主要功能；β1和β2亚单位在骨中表达类似，但γ亚单位在骨组织和细胞中的表达存在差异。

AMPK信号通路是调节骨代谢的重要通路。Cortizo等[8]发现AMPK激活可增加UMR106和MC3T3-E1成骨样细胞的增殖，并促进MC3T3-E1细胞的分化和矿化。Molinuevo等[9]发现激活未分化骨髓祖细胞中的AMPK可引起其碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性、Ⅰ型胶原酶合成、骨钙素表达和胞外钙沉积升高，并增强成骨细胞特异性转录因子Runx2/Cbfa1的表达。Kim等[10]发现AMPK激活可刺激MC3T3-E1细胞内BMP(bone morphogenetic protein，BMP)-2的mRNA表达和矿化，抑制AMPK活性可消除以上效应，说明AMPK激活可刺激MC3T3-E1细胞的成骨性分化。以上研究说明AMPK激活可刺激多种成骨样细胞的成骨性分化，AMPK信号通路对骨代谢具有重要调节功能。

敲除AMPKα或β亚基基因小鼠的骨量或骨细胞与野生型小鼠的显著差异是AMPK参与骨量调节最有力的证据之一。Shah等[7]首次对敲除AMPKα亚基小鼠的胫骨进行mCT扫描以分析其骨形态，发现AMPKα1亚基敲除小鼠的皮质骨和松质骨间隔减小；骨小梁间隙显著增加；骨面积、皮质骨厚度和指数、松质骨的体积、数量和厚度以及骨膜周长均显著降低；但骨髓区域和胫骨长度无变化；但AMPKα2亚基敲除小鼠胫骨的皮质骨和松质骨参数均无显著变化。Jeyabalan等[11]对缺乏AMPKα1亚基(Prkaa1-/-)和野生型小鼠实施卵巢去势术(ovariectomy,OVX)和/或间断甲状腺激素(parathyroid hormone,PTH)注射。OVX后的Prkaa1-/-和野生型小鼠骨质量均降低，野生型更著。OVX加间断PTH注射可增加野生型和Prkaa1-/-小鼠的松质骨/皮质骨指数，但野生型小鼠的骨骼参数增加更为明显。相反，Prkaa1-/-小鼠间断PTH注射引起的骨合成增加高于野生型小鼠，证明Prkaa1-/-小鼠对OVX引起的骨转换反应较弱，但是对间断PTH注射诱导的合成反应较强，说明AMPKα1激活在骨重建中具有重要作用。Kang等[12]也对Prkaa1-/-或Prkaa2-/-亚基小鼠的骨表型进行测量，结果显示缺乏α亚基小鼠的骨质量明显低于野生型，且Prkaa1-/-小鼠的骨量下降比Prkaa2-/-小鼠更为明显，并以松质骨为著。静态和动态骨组织形态计量学分析显示Prkaa1-/-小鼠骨形成和骨吸收均增加，且骨吸收高于骨形成；Prkaa2-/-小鼠骨吸收明显增加，而骨形成无明显变化。体外实验显示AMPKα1亚基可抑制RANK信号，AMPK缺陷与破骨细胞生成增加有关，说明AMPK可以抑制破骨细胞生成，AMPKα亚基参与骨代谢调节，α1对骨代谢影响显著高于α2亚基。Quinn 等[5]研究了AMPKβ亚基在骨重建中的调节作用，利用断层扫描仪对雌性小鼠股骨头进行扫描，与雌性野生型小鼠相比，雌性β1敲除小鼠股骨头的松质骨密度显著减少，但皮质骨密度、周长和厚度正常。组织形态学分析显示雌性β1敲除小鼠胫骨松质骨体积和数量较野生型明显减少，厚度不变；但成骨细胞和破骨细胞数量与野生型相比差异无统计学意义。对雄性β1敲除小鼠进行相同检测显示其松质骨结构、破骨细胞和成骨细胞数量差异无统计学意义，但类骨质体积显著减少。雄性β2敲除小鼠的股骨头松质骨质量减少，皮质骨密度、周长、厚度正常，胫骨松质骨体积和数量明显低于野生型，但β1和β2种系敲除后破骨细胞和成骨细胞数量无差异，证明AMPK不是破骨细胞体内分化所必需的，只有β1或β2亚型足以使成骨细胞分化，AMPK可能影响了成骨细胞和破骨细胞的功能。

AMPK还可通过其他途径影响骨代谢。Takatani等[13]用Saos-2人类成骨样细胞研究成骨细胞Wnt/β-catenin信号通路的AMPK调节作用，结果发现AMPK激活剂5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷(5-aminoimidazole-4-carboxamide 1-β-D-ribofuranoside，AICAR)可抑制Wnt3a诱导的TCF依赖性转录活性，氯化锂通过抑制β-catenin降解增强Wnt诱导的转录激活，但二甲双胍通过增加β-catenin的磷酸化并减少β-catenin蛋白水平抑制Wnt/β-catenin信号来抑制该效应。此研究显示AMPK通过减少成骨样细胞中的β-catenin水平减弱Wnt/β-catenin信号通路。Pantovic等[14]通过体外培养人牙髓间充质干细胞探讨其成骨性分化与AMPK/Akt/mTOR信号的关系，结果表明骨髓间充质干细胞的成骨性分化过程中，早期出现激活AMPK及其靶点Raptor有关，并同时抑制mTOR及其底物p70S6激酶；晚期可激活Akt/mTOR信号。AMPK敲除阻止早期mTOR的抑制，同时激活晚期Akt/mTOR信号。由此推论AMPK/Akt/mTOR信号参与骨髓间充质干细胞的成骨性分化过程。

3 降糖药与AMPK

3.1 二甲双胍：2型糖尿病的骨密度改变使学者推测降糖药二甲双胍可能影响骨代谢。大量实验证明二甲双胍可通过增加细胞内AMP/ATP比值使AMPK对其上游激酶LKB1反应更为敏感，并强效激活骨髓祖细胞、成骨样细胞和初级骨髓巨噬细胞中的AMPK。Cortizo等[8]用二甲双胍处理UMR106和MC3T3-E1成骨样细胞，发现其剂量依赖性提高细胞增殖，并促进成骨样细胞分化和矿化结节形成，二甲双胍诱导磷酸化ERK的瞬时激活和再分布，并剂量依赖性刺激内皮型一氧化氮合酶(edothelial nitric oxide synthase,eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)。Kanazawa等[15]发现二甲双胍剂量和时间依赖性激活AMPK，并诱导eNOS和BMP-2的表达，加入特异性AMPK抑制剂Ara-A显著逆转了二甲双胍诱导的eNOS和BMP-2表达，二甲双胍可剂量和时间依赖性激活AMPK通路并诱导成骨样MC3T3-E1细胞的分化和矿化。这些结果显示二甲双胍促进成骨样细胞的分化和矿物化，可能由ERK-1/2激活或再分布和诱导e/iNOS介导。

Jang等[16]研究了二甲双胍对成骨细胞分化影响的分子机制，发现其可显著增加主要成骨性基因如ALP、骨钙素、骨涎蛋白和小异二聚体伴侣分子(small heterodimer partner,SHP)的表达，腺病毒转染细胞过度表达SHP可显著增加细胞ALP染色和骨钙素生成水平，上游刺激因子1(upstream stimulatory factor-1，USF-1)特异性调节二甲双胍诱导的SHP基因表达。二甲双胍介导的AMPK激活还可增加Runt相关转录因子2(Runt-releated transcription factor,Runx2)的mRNA和蛋白水平，但USF-1和SHP未参与此过程。瞬时转染和染色质免疫共沉淀分析表明MC3T3-E1细胞中，二甲双胍增强SHP与Runx2在骨钙蛋白启动子上的相互作用，并形成复合物。这些结果显示二甲双胍可能通过AMPK/USF-1/SHP级联调控反式激活Runx2以刺激小鼠颅骨源性成骨细胞分化。Jang等[17]还发现二甲双胍诱导Smad1/5/8磷酸化和Dlx5与Runx2的表达，并增加BRE-Luc和Runx2-Luc活性，但这些均可被化合物C或AMPK显性失活可抑制；用siRNA下调Dlx5表达可以抑制二甲双胍诱导的Runx2表达。说明二甲双胍也可以通过激活AMPK调控Smad1/5/8-Dlx5-Runx2信号通路刺激成骨细胞分化。

Molinuevo等[9]研究了二甲双胍在体内和体外对骨髓祖细胞分化的影响，发现体内注射二甲双胍可引起颅骨损伤的非糖尿病小鼠和糖尿病大鼠的骨再生；在体外，二甲双胍可显著激活未分化骨髓祖细胞的AMPK，并部分抑制罗格列酮诱导的骨髓祖细胞成脂分化。体内和体外注射二甲双胍都会引起骨髓祖细胞ALP活性、Ⅰ型胶原酶合成、骨钙素表达和胞外钙沉积升高。此外，注射二甲双胍可时间依赖性增强成骨细胞特异性转录因子Runx2/Cbfa1的表达和AMPK激活。因此，二甲双胍所引起的体内和体外成骨效应可能与Runx2/Cbfa1表达升高和AMPK激活有关。

成骨细胞护骨素(osteoprotegerin，OPG)和Kβ受体活化剂(receptor activator of NF-Kβ ligand,RANKL)是由成骨细胞主要分泌的细胞因子，并对破骨细胞的分化和功能具有重要作用。Mai等[18]发现二甲双胍剂量依赖性刺激小鼠颅骨成骨细胞和MC3T3-E1成骨样细胞的OPG表达升高并减少RANKL mRNA表达，从而抑制破骨细胞分化。应用化合物C或钙调素依赖的蛋白激酶(calcaium/calmodulin-dependent protein kinase kinase,CaMKK)抑制剂STO-609阻止了二甲双胍诱导的OPG表达增加，而CaMKK是AMPK的上游激酶。这充分说明AMPK通路在成骨细胞的OPG表达中具有重要作用。Lee等[19]使用RANKL诱导骨髓源性巨噬细胞AMPKα亚基的激活和磷酸化，并刺激细胞形成破骨细胞-TRAP阳性多核细胞。发现在使用化合物C抑制AMPK和siRNA介导的AMPKα1敲除小鼠模型中，RANKL诱导的TRAP阳性多核细胞生成增加，同时通过激活下游信号元件p38、氨基末端激酶、核因子κB、Akt、CREB、c-Fos和活化T细胞核因子1蛋白(activation of T cell nucleus factor 1 protein,NFATc1)增加骨吸收。CaMKK抑制剂STO-609完全阻断RANKL诱导的α亚基激活，但是钙调蛋白依赖性激酶(calmodulin-dependent kinase，CaMK)抑制剂KN-93不能阻断。同时，siRNA介导的TAK1敲除也阻断了RANKL诱导的α亚基激活。因此，AMPK可能通过CaMKK和TAK1下调RANKL表达，从而抑制RANKL诱导的骨吸收。

3.2 噻唑烷二酮(thiazolidinediones,TZDs)：TZDs是临床上广泛应用的降糖药，主要通过激活过氧化物酶体增殖物活化受体γ(peroxisone proliferator activated receptors γ,PPARγ)来发挥作用。类似于二甲双胍，噻唑烷二酮也可通过增加细胞内AMP/ATP比值激活AMPK，继而使AMPK对LKB1反应更为敏感。Cho等[20]研究了罗格列酮对破骨细胞形成、骨吸收和成骨细胞分化的影响。罗格列酮不仅抑制了TRAP阳性细胞的形成，而且时间和剂量依赖性抑制骨髓细胞形成的骨吸收凹点。此外，罗格列酮使骨胶原和骨钙素水平降低至接近于零并阻止成骨细胞特异性蛋白的mRNA表达。但是，罗格列酮显著增加细胞中脂肪细胞特异性标志物aP2的mRNA水平。以上结果说明罗格列酮激活的PPARγ可抑制骨髓细胞中的成骨细胞分化，增加脂肪细胞形成，并阻止破骨细胞形成和骨吸收。上述研究说明噻唑烷二酮对骨代谢具有重要影响，但尚无研究证明此变化与AMPK有直接关系。

4 小分子化合物与AMPK

4.1 AICAR：AICAR是最早发现也是目前应用最广泛的AMPK激活剂。AICAR进入细胞并被腺苷酸激酶磷酸化为单磷酸化型(AICAR monophasphate,ZMP)，ZMP与AMP的作用类似，可变构激活AMPK并磷酸化上游激酶[21-22]。为研究AICAR对骨量的影响及其作用机制，Quinn等[5]向10周龄野生雄性小鼠注射AICAR。pQCT显示AICAR注射后小鼠的股骨头松质骨密度大幅降低(54%)，皮质骨厚度明显减少(15%)；组织形态学分析显示松质骨体积与对照组相比降低49%，松质骨数量明显降低，但厚度不变。AICAR注射后小鼠的破骨细胞数量和破骨细胞表面显著增加，同时类骨质体积和成骨细胞数量增加，表明AICAR会导致骨量减少和骨转换增加。为明确其机制，将骨髓细胞诱导的破骨样细胞接种于牙质表面，加入AICAR后破骨样细胞形成数量增加一倍，牙质吸收也增加一倍，这种破骨细胞增加数量和牙质吸收增加的量效关系，说明AICAR导致的骨吸收增加与破骨细胞数量增加密切相关，AICAR并不影响破骨细胞的活性。

AICAR对成骨细胞的影响是AMPK对骨代谢调节的另一方面。Shah等[7]通过分析大鼠成骨样细胞裂解产物的ALP活性和茜素红染色表明AICAR可剂量依赖性抑制矿化期的ALP 活性并刺激骨小结形成。Kanazawa等[23]用AICAR激活MC3T3-E1成骨样细胞中的AMPK并引起细胞增殖、分化和矿化增加，在此过程中细胞中osterix mRNA表达升高，因此推测Osterix转录因子可能参与此成骨细胞分化调节。在进一步研究中，Kanazawa等[15]发现AICAR明显刺激MC3T3-E1成骨样细胞矿化和eNOS、BMP-2、骨钙蛋白的mRNA表达；而NOS抑制剂、BMP拮抗剂、HMG-CoA还原酶下游分子和甲羟戊酸均可显著抑制AICAR诱导矿物质化和mRNA表达。Western blot分析显示AICAR可激活蛋白激酶B和细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，使用ERK抑制剂可显著抑制AICAR诱导的eNOS和BMP-2 mRNA表达。酶联免疫吸附试验进行的ROK活性检测显示AICAR显著抑制ROK亚基磷酸化。这些结果表明AICAR可通过激活AMPK介导甲羟戊酸途径刺激成骨细胞矿化。

4.2 噻吩并吡啶酮：已经开发2种可直接激活AMPK的噻吩并吡啶酮类小分子。第一个是由雅培公司开发的是化合物A769662，可独立于AMP结合位点，通过抑制26S蛋白酶体活性激活AMPK。虽然A769662不与AMP竞争，但其作用于AMP对AMPK的效应类似，这可能是一种理想的选择性AMPK激活剂。但由于A769662对蛋白酶体活性的抑制作用是可逆的，所以会导致细胞周期停滞，使用时应考虑此不良反应。de Meester等[24]从过度表达AMPKα1亚基的鼠骨髓中提取骨髓干细胞(mesenchymal stem cells，MSCSs)，并用A769662诱导AMPK持续强效激活。结果显示，AMPK激活可抑制MSCS增殖，但并未抑制AMPKα1敲除小鼠的MSCS增殖。同时，A768772可导致p27(AMPK调控细胞增殖的下游靶点)升高，而沉默p27表达可部分阻断A7629662引起的抑制MSCS增殖作用。说明AMPK持续激活可抑制MSCS增殖，p27参与此过程。第2个化合物是上海研究所开发的噻吩并吡啶酮PT1，通过与α亚基的AIS结合来激活AMPK，减轻激酶的变构抑制。这些研究证明小分子直接激活AMPK的可行性，并为将来AMPK激活剂的研究提供基础。

5 细胞因子与AMPK

5.1 瘦素：瘦素是第一个被证实能激活骨骼肌AMPK的激素，可抑制脂肪酸合成、促进脂肪酸氧化和葡萄糖利用。Solomon等[25]向4周龄小鼠皮下注射瘦素拮抗剂并进行骨骼分析，发现第1和第3个月注射的小鼠腰椎和胫骨的松质骨和皮质骨参数明显增加，同时胫骨生化指标明显增加；但对老龄小鼠(3～6个月)注射拮抗剂30d后对骨指标无影响，说明瘦素对骨代谢具有重要影响，但尚无研究证明AMPK参与瘦素对骨代谢的调节。

5.2 脂联素：脂联素是一种由脂肪细胞分泌的激素，可时间依赖性增加成骨细胞AMPKα亚基的Thr 172残基磷酸化[26]。Kanazawa等[27]为研究脂联素对成骨样MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿物质化的影响，通过脂联素受体1(adiponectin receptr 1,AdipoR1)小干扰RNA转染强效拆除脂联素受体mRNA，转染细胞中ALP活性、矿化、Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达均降低；BrdU分析显示脂联素还可促进细胞增殖。由此推论脂联素可通过AdipoR1和AMPK信号通路刺激成骨细胞增殖、分化和矿化。

Huang等[26]探讨了脂联素对BMPs表达的影响及其机制。脂联素可增加人成骨细胞(human fetal osteoblast,hFOB)AdipoR1表达，瞬时转染siRNA拮抗AdipoR1有效抑制成骨细胞BMP-2的表达，说明脂联素/AdipoR1受体相互作用在成骨细胞的BMP-2表达中具有重要作用。脂联素可增加MG-63、hFOB和MC3T3-E1成骨样细胞中BMP-2蛋白及其mRNA表达。预先AMPK抑制剂(Ara-A 或化合物C)显著减少细胞内脂联素诱导的BMP-2表达。为明确是α1还是α2亚基介导此效应，用AMPKα1或AMPKα2 siRNA转染细胞，发现只有AMPKα1 siRNA转染可拮抗脂联素诱导的BMP-2表达。脂联素可增加AMPK下游分子p38活性，AMPK抑制剂、p38特异性抑制剂SB203580预处理或显性失活p38突变体转染细胞抑制脂联素诱导的BMP-2表达。此外，AMPK抑制剂、SB203580、AMPKα1 siRNA和p38突变体也可减少脂联素介导的BMP-2启动子活性。因此，AMPKα1和p38信号分子介导了脂联素诱导的BMP-2表达。

Yamaguchi等[28]研究了脂联素对肿瘤坏死因子α和RANKL诱导的破骨细胞生成的影响。脂联素可强效抑制TNF-α/RANKL诱导的破骨细胞分化；在加入脂联素球状结构域之前预先用化合物C或p38抑制剂SB203580处理，化合物C可显著抵消脂联素球状结构域对肿瘤坏死因子α/RANKL诱导的破骨细胞生成和NFATc1表达的抑制作用，但SB203580对此无影响。说明AMPK在脂联素球状结构域对TNF-α/RANKL诱导的破骨细胞生成和NFATc1表达活性的抑制作用中具有重要作用，p38未参与此过程。

综上所述，AMPK通路对骨骼代谢具有一定的影响。由于其对骨形成和骨吸收的调节作用，AMPK可能成为较好的治疗骨质疏松症的药物靶点。体外研究支持AMPK激活可促进骨形成并抑制骨吸收，但是没有证据显示AMPK激活可在体内直接导致骨形成。目前所有相关研究存在的主要问题是用于激活AMPK的药物都是非特异性的。利用AMPK在骨骼和其他组织表达的不同亚型开发出骨特异性的AMPK激活剂可能成为抗骨质疏松症治疗非常有前景的切入点。然而，尽管过去十几年有关AMPK在糖尿病、肥胖、心血管疾病和骨质疏松症等各种代谢性疾病的生理作用有迅速的进展，但由于AMPK激活在全身的累积效应，要深入了解AMPK活化对于骨代谢的作用在能特异性干预AMPK之前仍然存在许多挑战。

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(本文编辑：刘斯静)

2014-02-22；

2014-03-05

河北省医学适用技术跟踪项目(GL2011-43)

高柳(1988-)，女，河北石家庄人，河北医科大学第三医院医学硕士研究生，从事内分泌与代谢疾病诊治研究。

*通讯作者。E-mail: liyukun@medmail.com.cn

R339.37

A

1007-3205(2014)09-1108-06