枸骨叶中芦丁的提取及含量测定

李艳芝 付英杰 王建安 季荣涛

（济宁医学院药学院，山东日照276826）

枸骨叶来源于冬青科冬青属植物枸骨（Ilex cornuta Lindl.et Paxt.）的干燥叶，具有清热养阴、益肾平肝等功效[1]。枸骨叶可以做苦丁茶用，是减肥及预防动脉粥样硬化的良好饮品[2]。研究表明，枸骨叶中主要含有三萜类[2－5]、黄酮类化合物[6]等，枸骨叶中芦丁的提取及含量测定未见文献报道。本文采用正交试验对枸骨叶中芦丁超声提取工艺进行研究，并采用高效液相色谱法建立其含量测定方法，旨在为进一步开发利用枸骨叶资源提供依据。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪SPD－10AVP，LC－10ATVP（岛津国际贸易上海有限公司）；TU－1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；BS224S电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 试药

枸骨叶采于济宁医学院日照校区本草园，烘干，粉碎过40目筛备用；芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号F20020428）；甲醇为色谱纯（天津市科密欧化学试剂有限公司）；其他试剂为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 枸骨叶中芦丁的提取

准确称取枸骨叶粉末100g，按要求加入一定量的提取溶剂，超声波提取一定时间，抽滤，提取液用石油醚脱色3次，弃石油醚层，萃取液旋转蒸发回收溶剂，用甲醇定容于250ml容量瓶中，作为待测液。

2.2 枸骨叶中芦丁含量的测定

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取105℃干燥至恒重的芦丁对照品0.0107g，置于100ml容量瓶中，加甲醇适量溶解，定容，得0.107mg／ml的芦丁溶液，待用。

2.2.2 样品溶液的制备 精密量取“2.1”项中待测液1ml于250ml容量瓶中，甲醇定容，摇匀，用微孔滤膜（0.45μm）滤过，即得样品溶液。

2.2.3 测定波长的确定 分别取对照品溶液和样品溶液，于200～600nm波长之间扫描，结果表明，两者均在356nm波长处有最大吸收，故选择356nm为测定波长。

2.2.4 色谱条件 Kromasil C18柱（150mm× 4.6mm，5μm）；流动相为甲醇－0.1%冰醋酸水溶液（45∶55）；柱温：室温（23℃）；流速：0.8ml／min；检测波长：356nm；理论塔板数按芦丁计算＞4000；保留时间为6.215min。

2.2.5 标准曲线的制备 精密吸取对照品溶液0.0、1.0、2.0、4.0、5.0、6.0ml置于10ml容量瓶中，用甲醇定容。分别取20μl进样3次，记录峰面积，以峰面积值（Y）对芦丁的浓度（X）进行线性回归，得回归方程为Y＝15587X＋20055，r＝0.9999，表明芦丁对照品在10.70～64.20μg／ml范围内线性关系良好。

2.2.6 样品含量测定 取“2.2.2”项中样品溶液，按上述色谱条件进样20μl，记录峰面积，根据回归方程计算，得各样品芦丁含量。

2.2.7 精密度试验 取同一供试品溶液各20μl，按前述色谱条件，连续重复进样5次，测定结果RSD为0.78%。

2.2.8 稳定性试验 同一份样品溶液分别隔2h进样1次，在10h内测定结果RSD为0.81%（n＝5），表明供试品溶液在10h内稳定。

2.2.9 重现性试验 称取同一批次药材样品，按样品制备方法制备5份，测定结果RSD为1.87%。

2.2.10 加样回收率试验 精密吸取已知芦丁含量的样品溶液，分别精密加入芦丁对照品溶液，配成低、中、高浓度各3份，在前述色谱条件下测定，计算加样回收率，结果见表1。

图1 芦丁对照品及枸骨样品高效液相色谱图

表1 加样回收率试验结果

2.3 单因素试验

2.3.1 提取时间对枸骨叶中芦丁提取量的影响准确称量枸骨叶粉末100g，分别加入8倍量90%乙醇超声提取，提取时间分别为20、30、40、50、60min，3次，分别测定芦丁含量，50min时提取含量最大。

2.3.2 乙醇浓度对枸骨叶中芦丁提取量的影响准确称量枸骨叶粉末100g，分别加入8倍量的60%、70%、80%、90%的乙醇，超声提取50min，3次，分别测定芦丁含量，70%乙醇提取的芦丁含量最大。

2.3.3 料液比对枸骨叶中芦丁提取量的影响 准确称量枸骨叶粉末100g，分别加入8、10、12、16倍量70%乙醇超声提取50min，3次，分别测定芦丁含量，12倍量的乙醇所得芦丁含量最大。

2.3.4 提取次数对枸骨叶中芦丁提取量的影响准确称量枸骨叶粉末100g，分别加入12倍量70%乙醇超声提取1次，2次，3次，4次，每次50min，分别测定芦丁含量，提取2次所得芦丁含量最大。

2.4 正交试验设计

为系统考察超声提取枸骨叶中芦丁工艺参数，根据单因素试验的结果，选用提取时间、乙醇浓度、料液比、提取次数作为考察因素，进行正交设计，选用L9（34）正交表，因素水平见表2。

表2 正交试验因素水平表

按表3所列各工艺制备样品，加乙醇后均浸泡1h后超声提取，计算芦丁提取量。正交试验结果和直观分析见表3，方差分析见表4。由分析结果可知影响枸骨叶中芦丁提取率的主次因素依次为：乙醇浓度＞提取时间＞提取次数 ＞料液比，其中提取时间和乙醇浓度有显著影响，最佳提取工艺为A2B3C2D3。由于料液比对提取率影响很小，提取2次和3次结果差异很小。从节约成本角度出发，确定最佳提取工艺为A2B3CD2，即用10倍量的90%乙醇，超声提取2次，每次50min。

表3 正交试验结果和直观分析

表4 方差分析数据表

2.5 验证实验

取3批枸骨叶药材，按照所得最佳提取条件进行提取，所得芦丁含量分别为1.83、1.97、1.68 mg／g，平均含量为1.83mg／g，高于正交试验中任何一组，表明所得提取工艺稳定可行。

3 结论

本文通过正交试验法得出了枸骨叶中芦丁的最佳超声提取工艺，并采用高效液相色谱法建立了其含量测定方法。所得提取工艺简便、稳定可行，为枸骨叶药效物质基础的进一步研究提供了快捷、经济、高效的提取手段；所建立的含量测定方法线性关系良好，重现性好，专属性强，为枸骨叶的质量控制和评价提供了科学依据。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[S].北京：化学工业出版社，2010：233.

[2]李维林，吴菊兰，任冰如，等.枸骨的化学成分[J].植物资源与环境学报，2003，12（2）：1－5.

[3]范志英.RP－HPLC测定无刺枸骨不同部位中齐墩果酸和熊果酸的含量[J].浙江中医杂志，2010，45（2）：144－145.

[4]姚志容，李军，周思祥，等.枸骨叶中的三萜类成分[J].中国中药杂志，2009，34（8）：999－1001.

[5]范琳琳，陈重，冯育林，等.枸骨根的化学成分研究[J].中草药，2011，42（2）：234－236.

[6]Zhou SX，Yao ZR，Li J，et al.Flavonoids from the leaves of I－lex cornuta[J].Chin J Nat Med，2012，10（2）：84－87.