斑马鱼胚胎发育过程中TGF-β1基因的表达特征分析

侯少丰 李艳丽 徐功玉 赵浩斌 周青春 钟雪萍

(华中师范大学生命科学学院, 湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室, 武汉 430079)

斑马鱼胚胎发育过程中TGF-β1基因的表达特征分析

侯少丰 李艳丽 徐功玉 赵浩斌 周青春 钟雪萍

(华中师范大学生命科学学院, 湖北省遗传调控与整合生物学重点实验室, 武汉 430079)

为研究转化生长因子β (Transforming growth factor β, TGFβ)1对斑马鱼胚胎发育的调控作用, 通过NCBI获得TGF-β1基因序列, TGF-β1 cDNA全长1571 bp, 编码377个氨基酸。系统进化树分析发现, TGF-β蛋白按照不同的类型严格聚类, 斑马鱼TGF-β1与其他鱼类的TGF-β1聚集到一个分支, 在进化中非常保守。对斑马鱼胚胎进行RT-PCR和Real-Time PCR检测显示, TGF-β1基因为母源表达基因, 在分节期之前的表达水平比较低, 而从咽囊期开始持续高水平的表达。胚胎整体原位杂交发现, TGF-β1基因在斑马鱼24 hpf 胚胎中开始有特异信号出现, TGF-β1基因的表达主要分布在腮弓、侧线原基、耳囊、嗅觉基板、心脏和前肾等处, 表明TGF-β1基因可能参与斑马鱼胚胎免疫调节、循环系统发育和侧线形成。用低氧处理斑马鱼胚胎,发现低氧处理24h后斑马鱼胚胎发育延迟。利用Real-Time PCR和胚胎整体原位杂交检测发现, 低氧处理后发育延迟的斑马鱼胚胎中TGF-β1 mRNA表达量较常氧组显著降低。以上结果表明, TGF-β1基因参与斑马鱼胚胎发育调控, 并且可能与低氧处理后斑马鱼胚胎发育延迟有关。研究结果将为深入研究斑马鱼TGF-β1基因的功能奠定基础。

斑马鱼; TGF-β1基因; 胚胎发育; 低氧

转化生长因子β (Transforming growth factor β, TGFβ)是由多个结构上相关的多肽生长因子组成的超家族, 在免疫调节、细胞外基质合成、细胞的生长分化、原始生殖细胞迁移以及组织损伤修复中发挥着巨大的作用［1］。转化生长因子 β超家族包括TGFβ、活化素(activins)、抑制素(inhibins)、缪勒管抑制物质/抗缪勒管激素(MIS/AMH)、生长分化因子(GDFs)、骨形成蛋白(BMPs)以及Nodal等亚家族。该家族绝大多数成员拥有包括丝氨酸-苏氨酸激酶受体和Smad蛋白的信号转导通路。TGFβ超家族成员可通过与细胞表面受体 TGFβR (/)ⅢⅡ 结合, 磷酸化 TGFβR , Ⅰ 激活 Smad蛋白。激活后的 Smad蛋白从胞浆转运至核内, 调节下游基因的表达。TGFβ超家族还可通过不依赖Smad蛋白的方式传递信号。TGFβ的信号转导过程受多种因子的精密调控[2—5]。

TGFβ信号途径在动物的生长发育过程中发挥重要作用。研究表明, 在脊椎动物的胚胎发育中, TGFβ信号途径可参与胚胎内胚层和中胚层的形成,调控胚胎体轴的图式形成, 影响胚胎神经发育和左右不对称发育[6—8]。缺少 Nodal信号的斑马鱼胚胎,内胚层完全缺失, 头部和躯干的中胚层缺失[9]。Nodal突变的小鼠胚胎不能正常形成原条, 而原条是由中胚层前体细胞组成[10]。BMP信号异常可导致斑马鱼和两栖类胚胎发育腹部化或背部化[11]。通过shRNA抑制小鼠胚胎干细胞BMP信号通路下游转录因子Ovol2的表达, 能显著削弱BMP信号对其神经分化的抑制和对中内胚层分化的促进作用[12]。

鱼类TGF-β亚家族有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β6 4种异构体, TGF-β1是TGF-β亚家族中表达最广泛的亚型。在鱼类中, TGF-β1cDNA全长序列分别在鲤鱼、金鱼和斑马鱼等中被克隆[13—17]。成鱼的TGF-β1 mRNA大量分布在胸腺、头肾、脾和外周血淋巴细胞, 在脑、肝、性腺、肌肉、眼等其他组织也能检测到。进一步的研究发现, TGF-β1参与鱼类生殖和免疫双重调控, 可调节鱼类卵母细胞的成熟、外周血液淋巴细胞的增殖和上皮内淋巴细胞的致敏性[14,15,18,19]。但目前尚无TGF-β1基因在斑马鱼胚胎发育中的时空表达和低氧应答的研究报道。本文采用RT-PCR、Real-Time PCR和胚胎整体原位杂交技术, 研究斑马鱼胚胎发育过程中低氧处理前后TGF-β1基因mRNA时空表达情况, 探讨其对胚胎发育的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

斑马鱼引自于中国科学院水生生物研究所。取健康、性成熟的斑马鱼, 于饲养系统关灯前将雌雄按1︰2的比例放入产卵缸内。次日给光后拿掉挡板,让其完成交配和产卵。收集、挑选正常发育的胚胎进行培养。培养温度28 , ℃ 光周期为明14h︰暗10h。

1.2 实验方法

低氧处理 将处于不同发育阶段的胚胎(6、24、48和72 hpf)置于低氧培养箱中用5% O2处理24h。在完成低氧处理后, 收取样品, 液氮速冻, 储存于–80℃冰箱。

RT-PCR和Real-time PCR检测TGF-β1基因的表达 分别收集发育至不同阶段的斑马鱼胚胎各30枚, 用Trizol法提取各自的总RNA, 具体步骤按照试剂盒说明书进行。DNaseⅠ酶解可能残余的基因组 DNA。用 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定所提取RNA的完整性。紫外分光光度法测定RNA样品的浓度和纯度。取各时期胚胎的总 RNA用逆转录酶Powerscrit和oligo(dT)合成第一链模板cDNA, 然后以cDNA 作为模板进行RT-PCR和Real-time RCR反应。以斑马鱼β-actin 基因作为参照。TGF-β1基因RT-PCR反应条件为: 95 ℃ 30s; 55 ℃ 30s; 72 ℃ 30s; 34个循环。TGF-β1基因Real-time RCR反应体系为: SYBR Green Mix 10 μL, DEPC H2O 1 μL, 上、下游引物(F、R) (10 mol/L)各0.5 μL, 模板cDNA (1︰10稀释) 8 μL, 总体积为 20 μL。PCR反应条件为: 95℃预变性 3min; 95 ℃ 10s, 58 ℃ 30s, 72℃ 30s, 35个循环。在每一个循环最后要设一个读板温度, 这一般根据目的基因情况而定。另一个要设的是融链温度分析的梯度温度。每一个样品重复 3次, 每个基因的表达量以β-actin为参照用2–ΔΔCt方法［20］进行数据处理及分析。

地高辛标记的正、反义RNA探针的合成 设计特异性引物将目的片段插入 pGEM-T Easy载体,阳性克隆送华大基因测序。重组质粒用M13引物线性化, 用地高辛标记试剂盒分别经SP6和T7 RNA聚合酶体外转录获得地高辛标记的正义 RNA探针和反义RNA探针。紫外分光光度计测定浓度, 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定 RNA探针的质量, 分装并于–80℃保存。

胚胎整体原位杂交 参照斑马鱼的胚胎整体原位杂交方法［21］进行。所有杂交所用的溶液和移液管都用DEPC处理。

表1 实验中所用引物序列Tab. 1 Primers used for all the experiments

照相、统计与生物信息学分析 斑马鱼胚胎用体视显微镜(Nikon SMZ 1500)进行观察、拍照。用 Image J1.41软件测量照片上胚胎的体长和头身角(head-trunk angle, HTA)。斑马鱼TGF-β蛋白的系统进化树用MEGA4软件构建。Real-Time PCR数据用Origin6.1软件中T-test方法来分析差异显著性。测量数据用 Means±standard error (SE)的图形来表示。当P＜0.05时认为差异性显著。

2 结果

2.1 斑马鱼 TGF-β1家族的系统进化分析

从NCBI查得斑马鱼的TGF-β1基因序列。斑马鱼TGF-β1 cDNA全长1571 bp, ORF为1134 bp, 编码377个氨基酸蛋白。为了研究TGF-β1蛋白的进化关系, 我们用MEGA4构建TGF-β家族进化树(图1)。分析该进化树, 发现人和其他动物的 TGF-β蛋白, 按照 TGF-β不同的类型严格聚类。斑马鱼TGF-β1则与其他鱼类的TGF-β1聚集到一个分支上,与虹鳟和鲫鱼的关系最近, 与两栖类和哺乳类的关系较远。

图1 TGF-β家族的系统进化关系Fig. 1 Phylogenetic relationship within the TGF-β protein family Am. Ambystoma mexicanum; Dr. Danio rerio; Ca. Carassius auratus; Cc. Cyprinus carpio; Om. Oncorhynchus mykiss; Pm. Pagrus major; Xl. Xenopus laevis; Rn. Rattus norvegicus; Hs. Homo sapiens; Gg. Gallus gallus; Pt. Pan troglodytes

2.2 斑马鱼TGF-β1基因在胚胎发育过程中的时序表达分析

采用 RT-PCR和 Real-Time PCR方法检测了TGF-β1基因在斑马鱼胚胎发育不同时期的表达情况。如图2所示, 从受精卵开始, 即可检测到斑马鱼TGF-β1基因转录本的存在, 说明斑马鱼TGF-β1基因是母源表达基因。TGF-β1基因在分节期之前的表达水平比较低, 而从咽囊期开始上升, 该基因的高水平表达一直持续到胚胎出苗。

图2 RT-PCR (A)和Real-Time PCR (B)分析TGF-β1基因在斑马鱼胚胎不同发育阶段的表达Fig. 2 The expression pattern of TGF-β1 gene in different stages of zebrafish embryogenesis by RT-PCR (A) and Real-Time PCR (B)

2.3 斑马鱼TGF-β1基因在胚胎发育过程中的空间表达分析

用地高辛标记的RNA探针对2、8、12、24、36、48和72 hpf斑马鱼进行了整体原位杂交分析(图3)。结果表明, 在64-细胞期(2 hpf)、胚盾期(6 hpf)、75%-外包期(8 hpf)和 12 hpf胚胎中均未检测到TGF-β1基因的表达。在24 hpf斑马鱼胚胎我们开始检测到了TGF-β1基因mRNA的阳性信号, 直到出苗期(72 hpf)TGF-β1基因都持续高水平表达。在斑马鱼胚胎受精后24h, 我们检测到TGF-β1在鳃弓和肾原基处有明显的表达, 在心脏原基处有少量的表达。在斑马鱼胚胎受精后36h, TGF-β1在腮弓处的表达量逐渐增强, 直到受精后 72h, 其表达量都维持在较高的水平。另外, 结果还发现此时期TGF-β1在嗅觉基板、肾原基、原始泄殖器官和侧线原基处的表达也很明显, 在心脏区域的表达量开始增强。到斑马鱼胚胎受精后48h, TGF-β1在腮弓和肾原基的表达维持在较高水平, 在心脏和表皮处 TGF-β1表达也很明显。在斑马鱼胚胎受精后72h, TGF-β1的表达部位主要集中在腮弓、前肾、心脏和泄殖器官。

2.4 低氧处理后斑马鱼胚胎发育过程中TGF-β1基因的表达分析

图3 整体原位杂交检测TGF-β1基因在斑马鱼胚胎发育过程中的时空表达Fig. 3 Expression pattern of TGF-β1 gene revealed by WISH during zebrafish embryogenesis

取受精后 12h的斑马鱼胚胎于 5%低氧条件下处理24h, 观察其表型。实验结果显示, 处理组较对照组生长发育明显迟缓(图4)。取斑马鱼不同发育时期(6、24、48和72 hpf)的胚胎分别进行低氧处理24h,然后用 Real-time RT-PCR检测低氧处理后 TGF-β1基因表达水平的变化。Real-time RT-PCR检测结果显示, 不同发育时期的胚胎低氧处理24h后TGF-β1基因mRNA的表达量均显著下降(图 5)。将48 hpf的斑马鱼胚胎处理 24h后用原位杂交的方法检测TGF-β1基因的表达情况。通过显微镜照相和用Image J1.41对阳性信号进行灰度分析, 发现低氧处理抑制了斑马鱼早期胚胎中TGF-β1基因的表达。

图4 低氧处理24h后斑马鱼胚胎表型、头身角和体长的变化(*代表P＜0.05)Fig. 4 The phenotype, HTA and body length of zebrafish embryo after hypoxia exposure for 24h

图5 Real-Time PCR(A)和整体原位杂交(B)检测斑马鱼胚胎低氧处理前后TGF-β1基因表达情况(*代表P＜0.05, **代表P＜0.01)Fig. 5 TGF-β1 mRNA level in zebrafish embryos in control and hypoxia treatment detected by Real-Time PCR(A) and whole-mount in situ hybridization(B)

3 讨论

转化生长因子-β是一类分泌性的信号分子超家族, 包括60多个成员。TGF-β类分子以前体形式合成, 加工后形成有活性的成熟形式, 其成熟单体之间通过二硫键形成二聚体。TGF-β超家族在早期发育中发挥重要作用。BMP信号途径参与脊椎动物及果蝇胚胎的背腹轴图式的形成。Nodal信号途径在脊椎动物胚胎中胚层的图式形成及左右轴的建立过程中起关键作用。本研究拟通过利用RT-PCR、整胚原位杂交和Real-Time PCR技术研究TGF-β1基因在低氧处理前后斑马鱼早期发育阶段的表达情况, 为进一步研究其在斑马鱼早期胚胎发育过程中的作用奠定基础。

本研究利用RT-PCR检测发现, TGF-β1基因在斑马鱼未受精卵中表达, 说明斑马鱼 TGF-β1基因是母源表达基因。斑马鱼胚胎 TGF-β1基因在分节期之前也有表达, 但表达水平比较低, 从 24 hpf之后开始持续高水平的表达。原位杂交结果显示TGF-β1基因在胚胎24 hpf后开始被检测到, 直到出苗期(72 hpf)都持续高水平表达。斑马鱼早期胚胎发育过程中TGF-β1基因的表达趋势与小鼠基本一致。Northern blot分析表明, 小鼠TGF-β1,2,3在胚胎发育过程中均有表达, 并且随着胚胎的生长发育mRNA水平逐渐增加[22]。原位杂交方法检测小鼠胎儿体内TGF-β1基因的表达情况, 发现TGF-β1基因主要表达在胚胎的中胚层如: 胚肝和卵黄造血岛的造血细胞, 一些器官的间叶细胞和骨化组织[23]。在本实验中, 用原位杂交的方法在斑马鱼2, 6, 8和12 hpf胚胎中未检测到TGF-β1基因的表达, 可能是由于在这几个发育时期 TGF-β1基因表达量少, 且原位杂交方法检测灵敏度较RT-PCR方法低的缘故。在小鼠胚胎 TGF-β1基因的时序表达模式研究中也发现过类似现象, RT-PCR方法研究表明小鼠TGF-β1基因在植入前的胚胎中就能检测到表达, 而原位杂交的方法在小鼠 7p.c的胚胎中才检测到TGF-β1基因的表达[23,24]。此外, 本实验检测到斑马鱼TGF-β1基因是母源表达基因。有研究表明, 母源TGFβ信号是斑马鱼胚盾和中轴中胚层正常发育必不可少的, 一旦母源 TGFβ信号活性受阻, 则会引起胚盾及中轴中胚层发育异常[25]。因此斑马鱼TGF-β1基因对于斑马鱼胚胎早期发育有非常重要的意义。

原位杂交结果显示在斑马鱼胚胎发育过程中, TGF-β1基因表达主要分布在鳃弓、前肾、侧线原基和原始泄殖器官等处。斑马鱼 TGF-β1基因的分布与其功能相一致。TGF-β1基因在前肾中的持续表达可能与其免疫调节有关。已有的研究表明 TGF-β1基因可调节外周血液淋巴细胞的增殖和上皮内淋巴细胞的致敏性[15,18,19]。TGF-β1基因在鳃弓、前肾和心脏中的表达显示斑马鱼 TGF-β1基因可能参与斑马鱼胚胎循环系统的发育。有研究表明, 在小鼠的胚胎发育过程中, 小鼠 TGF-β1基因主要在循环系统中表达, 分布于胚胎的卵黄血岛、尿囊和前心脏中胚层。TGF-β1基因缺失造成卵黄的血管形成和造血功能缺陷, 表现为卵黄缺血, 继而造成胎儿出生前死亡[23]。此外, TGF-β1基因在侧线原基的表达表明该基因可能参与侧线的发育。这一结果与相关研究相一致。最新研究发现, TGF-β1基因敲降阻碍了斑马鱼侧线的形成[26]。因此, 原位杂交结果表明TGF-β1基因可能参与斑马鱼胚胎免疫调节、循环系统发育和侧线形成。

TGF-β 基因的表达异常与缺血缺氧性疾病及肿瘤的发病机制及病理改变有关。在哺乳动物中,大量体内实验证明组织缺血、创伤和肾移植时局部的急慢性低氧均会诱导TGF-β 基因表达上调［27］。另有离体实验发现, 体外培养的人肝癌细胞HepG2和小鼠的BV-2细胞在低氧条件下TGF-β1 mRNA水平上调, 并且 TGF-β1表达量的增加可增强细胞对恶劣环境的耐受能力[28,29]。此外, 研究还发现低氧条件下 TGFⅢ受体(TGFBR3)可保护小鼠心脏纤维原细胞, 抑制低氧诱导的细胞凋亡［30］。本研究的结果发现, 低氧处理斑马鱼胚胎后, 斑马鱼胚胎生长发育迟缓, TGF-β1基因开始大量表达的时间延迟, 表达水平显著下降, 表明 TGF-β1基因的表达异常可能与低氧导致的斑马鱼胚胎损伤有关。TGF-β1基因在斑马鱼低氧适应/损伤中的功能及作用机制还有待进一步研究。

以上结果表明, TGF-β1基因参与斑马鱼胚胎发育调控, 并且可能与低氧处理后斑马鱼胚胎发育延迟有关。本研究结果将为深入研究斑马鱼 TGF-β1基因的功能奠定基础。

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ANALYSIS OF THE EXPRESSION OF TGF-β1 GENE IN ZEBRAFISH EMBRYOGENESIS

HOU Shao-Feng, LI Yan-Li, XU Gong-Yu, ZHAO Hao-Bin, ZHOU Qing-Chun and ZHONG Xue-Ping
(Hubei Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrative Biology, College of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, China)

Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) is a pleiotropic cytokine and is involved in the regulation of key events in development, disease, and tissue repair. Here we explored the expression of TGF-β1 in zebrafish of which the full cDNA consists of 1571 bp and encodes 377aa. The sequence of this gene was obtained from NCBI. Phylogenetic analysis revealed that TGF-βs were classified strictly with the same type of proteins. TGF-β1 of zebrafish was classified on the same branch of the phylogenetic tree with TGF-β1s of other fish. RT-PCR of this gene at different embryonic stages showed that TGF-β1 existed in unfertilized eggs of zebrafish. The expression started to increase at 24hpf and maintained a high level until 72hpf. Whole-mount in situ hybridization (WISH) analysis showed that TGF-β1 transcripts could be first detected in embryos at 24hpf and increased noticeably at later developmental stages. TGF-β1 transcripts were mainly expressed in gill arches, lateral line primordium, otic vesicle, olfactory placode, heart and pronephros. These indicated that TGF-β1 might play an essential role in immunoregulation, lateral line formation and vasculogenesis. Furthermore, the effect of hypoxia on the expression of TGF-β1 in zebrafish embryogenesis was evaluated with RT-PCR, Real-Time PCR and WISH. After the hypoxia treatment the development of embryos was delayed and the expression of TGF-β1 in embryos decreased dramatically. These results suggested that TGF-β1 played an important role in zebrafish embryogenesis and might be related to the hypoxia-induced delay in zebrafish embryonic developement.

Zebrafish; TGF-β1; Embryogenesis; Hypoxia

Q781; S917

A

1000-3207(2014)06-1054-08

10.7541/2014.155

2013-10-31;

2014-02-26

国家自然科学基金项目(30972254, 31272645); 中央高校基本科研业务费专项资金科研项目(CCNU12A02007)资助

侯少丰(1988—), 河南省林州市人; 硕士研究生; 研究方向为遗传学。E-mail: houshaofeng0921@163.com

钟雪萍, E-mail: zhongxueping@mail.ccnu.edu.cn