Nec-1对冈田酸诱导的大鼠皮层神经元损伤的保护作用

李艳丽，王增仙，武敏霞

生理条件下，蛋白磷酸酶2A（PP2A）与蛋白激酶调节微管相关蛋白tau蛋白磷酸化水平，处于低水平磷酸化的动态平衡［1］。冈田酸（okadaic acid，OA）是一种蛋白磷酸酯酶抑制剂，对PP2A有特异性抑制作用［2］。OA能使神经元tau蛋白异常过度磷酸化，继而引起神经元毒性［3］。

Degterev等［4］研究发现，在细胞内不存在凋亡信号时，Fas／TNFR能活化一种非凋亡的死亡途径，称为坏死性凋亡（necroptosis）。同时，他们发现一种小分子物质necrostatin-1（Nec-1）可以特异且有效地抑制坏死性凋亡。本研究旨在探讨Nec-1对OA诱导的神经元损伤是否有抑制作用。

1 材料与方法

1.1 试 剂 DMEM／F-12 和 胎 牛 血 清 （Gibco-BRL）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）、calcein-AM（Dojindo）；OA、阿糖胞苷、多聚赖氨酸、Nec-1（Sigma）；胰蛋白酶（Biosharp）；乳酸脱氢酶（LDH）（南京建成生物工程研究所）。

1.2 原代细胞培养 取新生1 d～3 d Wistar大鼠，分离大脑皮层，用胰酶消化制备单细胞悬液。细胞悬液经1 000 r／min离心5 min，弃上清，用完全培养液（DMEM／F-12培养基＋15%胎牛血清）重悬细胞。然后接种于培养瓶或培养板上，在37℃，5%CO2的孵育箱培养。24 h后加入10μmol／L阿糖胞苷。成熟的神经元（8 d～10 d）用于实验。

1.3 实验分组 将 Wistar大鼠分为5组，对照组、OA组（10 nmol／L）、Nec-1组在加入OA前24 h加入不同浓度的Nec-1（10μmol／L，30μmol／L，100μmol／L）预孵育。

1.4 细胞活力检测 细胞在96孔板培养（100μL／孔），向各孔加入10μL CCK-8溶液，在37℃，5%CO2的孵育箱孵育2 h，用酶标仪测定490 nm处OD值。

1.5 LDH的检测 当细胞遭受损伤时，LDH由胞浆释放到胞外。加入OA 24 h后，收集培养液检测LDH活性。

1.6 calcein-AM染色 细胞与calcein-AM避光孵育20 min，PBS避光洗涤两次，在490 nm激发波长，515 nm发射波长的滤光片的荧光显微镜下观察细胞。

1.7 统计学处理 计量资料用均数±标准差（x±s）表示。组间比较采用单因素方差分析，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Nec-1抑制OA引起的细胞活力的下降 CCK-8细胞活力检测发现OA引起皮层神经元损伤。与对照组相比，将神经元暴露于OA 2 h，细胞活力降至（52.55±2.86）%（P＜0.01）。在OA作用前24 h用Nec-1预处理神经元可以抑制OA引起的细胞活力的下降。Nec-1（30μmol／L）和 Nec-1（100μmol／L）分别使其增加10%（P＜0.05）和19%（P ＜0.01），但 Nec-1（10μmol／L）并不能抑制OA引起的细胞活力的降低。详见图1。

图1 Nec-1抑制OA引起的细胞死亡

2.2 Nec-1抑制OA引起的LDH释放的增加 皮层神经元暴露于OA可引起LDH的释放。OA处理后，LDH水平与对照组相比增加44.36%（P＜0.01）。Nec-1（30μmol／L）和 Nec-1（100 μmol／L）预处理分别使LDH释放减少13%（P＜0.05）和21%（P＜0.01）。详见图2。

图2 Nec-1抑制OA引起的LDH释放

2.3 Nec-1抑制OA引起的活细胞数的减少 Calcein-AM染色结果发现OA可引起活细胞数减少。OA处理后，Calcein-AM染色阳性的神经元（代表活细胞）与对照组相比减少45.16%（P＜0.05）。与 OA处理组相比，Nec-1（30μmol／L）和Nec-1（100μmol／L）分别使活细胞数增加11%（P＜0.05）和20%（P＜0.01）。

3 讨 论

阿尔兹海默病（AD）是引起老年期痴呆最常见的原因。随着我国人口结构的逐步老龄化，该病的高发病率和危害性也越来越被关注。其主要的病理特征是脑内出现老年斑和神经纤维缠结（NFT）［5］。过度磷酸化的tau蛋白是形成神经纤维缠结的主要成分，在AD发病中发挥重要作用［6］。

PP2A是脑内调节tau蛋白去磷酸化的主要磷酸酶［7］。研究报道，AD病人脑中PP2A活性降低30%左右。PP2A活性降低是导致AD病人tau蛋白过度磷酸化的主要原因［8］。OA是一种特异性的PP2A抑制剂，在体内或体外条件下，OA可使神经细胞内微管相关蛋白tau过度磷酸化，最终导致神经细胞退化［9］。

坏死性凋亡是新近发现的一种细胞死亡方式，Nec-1为其特异且有效的抑制剂，有可能成为临床治疗疾病的一个新靶点［4］。研究发现Nec-1可抑制中风模型或创伤性脑损伤（TBI）模型中的脑损伤［10，11］。前期研究也发现Nec-1抑制NMDA诱导的兴奋性神经毒作用［12］。

本研究发现Nec-1可以抑制OA诱导的大鼠皮层神经元损伤。已证实Nec-1抑制OA引起的细胞活力的降低、LDH释放和活细胞数的减少。这些结果均表明Nec-1对OA诱导的大鼠皮层神经元损伤有保护作用。Nec-1为坏死性凋亡的特异性抑制剂，证明在OA诱导tau蛋白磷酸化引起的神经元损伤中，坏死性凋亡起着重要作用，可以为AD疾病的治疗提供新的靶点。

Tau蛋白过度磷酸化使tau蛋白结合微管能力降低［13］，神经元轴突转运障碍［14］，导致神经元呈慢性进行性变性。本研究表明在神经元变性过程中有坏死性凋亡的参与。尽管其作用可能只占其中一部分，但坏死性凋亡级联反应是可调节的，所以它可能会为AD的治疗提供一个新的甚至更有效的靶点。

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