点阵Er:YAG激光对小鼠皮肤胶原纤维及弹性纤维的影响

苏明瑛 彭琳琳 刘之力

点阵Er:YAG激光对小鼠皮肤胶原纤维及弹性纤维的影响

苏明瑛 彭琳琳 刘之力

目的: 评价不同能量点阵铒:钇铝石榴石(Er:YAG)激光对小鼠皮肤胶原纤维及弹性纤维的影响。方法: 根据激光照射能量的不同将126只雌性昆明种小鼠分为高能量组(75 J/cm2)、低能量组(43.8 J/cm2)和对照组，观察每组不同时间皮肤组织学变化。结果: 高能量组胶原纤维、弹力纤维数量及真皮厚度高于低能量组，但红斑水肿期延长；在接受激光照射后1个月内，胶原纤维、弹力纤维增加速度较快。结论: 随着照射能量的增加，点阵(Er:YAG)激光对真皮层胶原及弹力纤维的增生刺激相应增强，但相应的副作用也随之增加。

点阵Er:YAG激光； 弹力纤维； 胶原纤维

点阵铒:钇铝石榴石(Er:YAG)激光为气化型点阵激光，最近几年，国内外学者已经应用点阵(Er: YAG)激光治疗毛孔粗大，皱纹及痤疮瘢痕等，并取得了比较满意的临床效果，1，2但对疗效的报道大部分是主观评价，对激光照射后组织学变化的研究比较少。本实验通过对小鼠背部行点阵(Er:YAG)激光照射治疗后真皮胶原纤维及弹力纤维的变化的研究进一步明确点阵激光的治疗机制，为临床治疗提供一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组方法 随机取126只雌性昆明种小鼠(大连医科大学动物实验中心提供)体重20±3 g，8～10周龄。分为高能量组、低能量组和对照组，每组42只，按照射后的时间1 h，1 d，3 d，7 d，14 d，28 d，56 d，再分为7小组，每小组6只。激光照射前照射区用75%乙醇常规消毒干燥后，使用点阵Er:YAG激光器单脉冲连续扫描打点照射，低能量组照射参数为43.8 J/cm2，175μm，70 spot/cm2，高能量组照射参数为75 J/cm2，300μm，70 spot/cm2，面积均为2.0 cm× 2.0 cm，只照射1遍，不重复，照射后用红霉素眼膏涂于创面上，只涂搽1遍。

1.2 主要设备和试剂 Contour Profile超级平台Er: YAG激光器(美国scion公司)；弹力纤维EVG染色液(广州市意威医疗器械有限公司)；冰冻切片机HM52(德国美康公司)；半自动轮转切片机HM340E (德国美康公司)；组织包埋机型号EC350(德国美康公司)；全自动染色剂(HMS740)(德国美康公司)；光学显微镜(50i)(日本奥林巴斯公司)；自动组织脱水机(Citadel)(英国三顿公司)；彩色病例图像分析系统(MED6.0)(北京表克奥迪图像技术有限公司)。

1.3 取材及实验方法 分别于照射后1 h，1 d，3 d，7 d，14 d，28 d，56 d，切取高能量组、低能量组和对照组皮肤样本5 mm×5mm×3mm。所有标本均4%甲醛浸泡固定，石蜡包埋后切片，切片厚度为4.5μm。另对照射后1 h标本石蜡连续切片，观察高能量组及低能量组凝固层深度与宽度的不同，其余6组常规石蜡切片，HE染色后各组切片随机选2个视野行真皮厚度测量和胶原纤维分布的观察；EVG染色观察弹力纤维分布。

1.4 统计学方法 结果用¯x±s表示，数据分析应用SPSS 11.5软件，采用one－way ANOVA方差分析，检验水准选择0.05。

2 结果

2.1 大体形态 昆明种小鼠背部皮肤经点阵(Er: YAG)激光照射后，皮肤即刻出现一系列紧密排列的局灶性锥状汽化剥脱微损伤，高能量组可见局灶性微损伤区轻度点状出血及较多量组织液渗出，微损伤区中央凝固区范围大于低能量组；照射后1～2 d微损伤区皮肤轻度发红，出现炎症反应，自3～4 d开始炎症和坏死组织逐渐形成痂皮并脱落，6 d内痂皮脱落完全。

2.2 HE染色 照射后不同阶段昆明鼠皮肤组织镜下表现不同，激光照射后1 h，对标本石蜡切片连续切片，测多点凝固层宽度及深度取平均值，高能量组凝固层宽度0.5 mm，深度0.18 mm；低能量组凝固层宽度0.4mm，深度0.1mm。照射后1 d和3 d，镜下表皮层及真皮层均无明显变化；照射后7 d，HE染色可见微损伤区域的真皮浅部呈现胶原纤维轻度增生，但比较纤细，而且排列无序；照射后14 d真皮层增厚显著，胶原纤维增生明显，细小的胶原开始由粗胶原代替；照射后28 d完全由粗长的胶原代替，胶原排列致密，表皮也更加完整平滑，56 d时，胶原纤维仍粗大致密，且真皮层厚度仍明显高于对照组(图1、2)。

图1 小鼠皮肤照射第7天皮肤组织镜下表现:a～c分别为低能量组、高能量组和对照组(HE，×100)

图2 小鼠皮肤照射第28天皮肤组织镜下表现:a～c分别为低能量组、高能量组和对照组(HE，×100)

在照射后7 d时，真皮层厚度开始略有增加，且高能量组增加幅度大于低能量组；在照射后28 d，真皮层厚度增加更加明显(表1)，两组与对照组比较有显著性差异(P＜0.05)；随照射后时间的推移，真皮层厚度逐渐增加，高能量照射组相对于低能量照射组，在相同时间段内，胶原纤维增生更加明显，真皮层厚度增加也更为明显，有显著性差异(P＜0.05)；

2.3 弹力纤维EVG染色 低能量照射组弹力纤维增生、重组不明显，高能量组从照射后14 d开始，可见弹力纤维含量明显高于对照组(图3)。

表1 照射后第3 d，7 d，14 d，28 d，56 d激光组和对照组真皮厚度的比较

图3 照射后第28天小鼠皮肤弹力纤维染色:a，低能量组；b，高能量组(EVG，×100)

3 讨论

点阵(Er:YAG)激光作用于小鼠皮肤后，皮肤即刻出现一系列紧密排列的局灶性锥状汽化剥脱微损伤(MTZ)，照射后发现采用43.8 J/cm2能量照射小鼠背部皮肤时，照射区只出现局灶状点状凹陷，周围伴炭化的棕色组织碎屑，当能量增加到75 J/cm2时，微损伤区出现明显点状出血及组织液渗出，微损伤区中央凝固区范围大于低能量组；激光照射后1 h，HE染色后连续切片，测多点凝固层宽度及深度取平均值，高能量组凝固宽度与深度都大于低能量组；1 d后高能量组照射区皮肤略红肿，结痂明显，低能量组皮肤表面无明显红肿及结痂，且低能量组照射区毛发生长快于高能量照射区；6 d后高能量照射区结痂完全脱落，皮肤表面无瘢痕。由此可见在微孔密度一定条件下，当能量增大时，治疗深度、宽度、凝固厚度及热凝固深度相应加深，治疗的深度与能量成正比，MTZ的大小与激光治疗的深度成正比，既能量越大，治疗深度越深，形成微损伤区的宽度越大。3HE染色及EVG染色发现，在相同时间段内，高能量照射组的真皮层厚度、胶原纤维及弹力纤维含量均明显大于低能量照射组，说明随着照射能量的增加，点阵(Er:YAG)激光对真皮层胶原及弹力纤维的刺激也相应增大，从而治疗效果也相应增加，与Trelles等的研究相吻合，4，5然而过高能量的治疗，往往也会带来很多副作用，如红斑水肿期的延长，感染机会的增加等。在临床工作中，对皮肤老化较重的患者，根据实际情况，可以相应这些增加治疗强度以获得更好的治疗效果，但也要注意伴发的不良反应。

在照射后第3 d肉眼观察照射部位皮肤表面结痂，高能量组及低能量组相对于对照组真皮层无明显增厚，胶原纤维含量无明显差别，第7 d，高能量组及低能量组相对于对照组真皮层开始增厚，胶原纤维略有增加，说明从点阵(Er:YAG)激光照射后第7 d开始，嫩肤作用开始缓慢体现，在28 d，HE染色高能量组及低能量组相对于对照组真皮层增厚明显，胶原排列紧密，高能量组真皮层厚度及胶原含量高于低能量组；EVG染色高能量组弹力纤维新生重组，排列紧致有序，嫩肤效果明显，切取照射部位周围小鼠皮肤，发现胶原纤维增生的面积大于原有照射面积。研究报道，点阵激光照射后期的真皮重塑远远超出MTZ范围。6，7激光照射1个月左右，无论从真皮层增加的厚度，还是胶原、弹力纤维排列的紧密程度都达到了顶峰，然而，此时并没有达到治疗的终点，在照射后56 d时，真皮层厚度及胶原、弹力纤维含量仍在继续增加，只不过增加的速度变得缓慢，因此，点阵激光的远期效果较好。在低能量照射组，EVG染色后弹力纤维无明显变化，可能与小鼠真皮层较薄弹力纤维含量较少，细微变化不能在组织切片中明显体现有关。

本研究表明，点阵Er:YAG激光照射小鼠背部皮肤后即刻形成紧密排列的局灶性锥状汽化剥脱微损伤，一方面局灶性微损伤可加速皮肤早期愈合，另一方面这种点阵状热刺激会均匀的启动皮肤的自我修复程序，最终导致包括表皮和真皮在内的全层皮肤发生重塑和重建，从而改善皮肤的衰老状态。在微孔密度一致情况下，随激光照射能量的增加，对真皮层的刺激将不断增加，进而达到更明显的嫩肤效果。在临床治疗中，我们发现，在接受点阵(Er:YAG)激光照射后1～3 d，被照射者皮肤出现潮红、肿胀、轻微渗出，这是(MTZ)在进行自我修复，此时应给予心理疏导，缓解被照射者紧张情绪，配合外敷医用修复面膜促进水肿消退，口服维生素C预防色沉形成；6 d内修复完成，表皮结痂大部分脱落；3～7 d，被照射者皮肤轻微干燥，皮肤略显肿胀，此时真皮层增厚明显，不排除真皮组织水肿，此时胶原纤维及弹力纤维开始出现，呈不规则排列，形状纤细。7 d开始内部重组显著出现，至28 d时真皮层增厚明显，胶原、弹力纤维重新致密排列，被照射者皮肤光泽度、弹性增加，至56 d真皮层仍增厚，胶原、弹力纤维仍在缓慢增生，临床上观察到被照射者皮肤弹性仍增加，皱纹减轻，满意度增加，这与实验所得到的结果相符，为临床提供了理论指导。我们将继续随访观察患者恢复情况，以明确其远期疗效。

1 Lapidoth M，Yagima Odo ME，Odo LM.Novel use of erbium: YAG(2，940 nm)laser for fractional ablative photothermolysis in the treatment of photodamaged facial skin:apilot study.Dermatol Surg，2008，34(8):1048－1053.

2吴严，李远宏.点阵式Er:YAG激光治疗痤疮瘢痕及毛孔粗大的疗效观察.中华皮肤科杂志，2010，43(2):105－107.

3 Bedi VP，Chan KF，Sink RK，et al.The effects of pulse energy variations on the diamensions of microscopic thermai treatment zones in nonablative fractional resurfacing.Lasers Surg Med，2007，39(2):145－155.

4 Trelles MA，Mordon S，Velez M，et al.Results of fractional ablative facial skin resurfacing with the erbium:yttium－aluminium－garnet laser 1 week and 2 months after one single treatment in 30 patients.LasersMed Sci，2009，24(2):186－194.

5 Trelles MA，VelezM，Mordon S.Correlation of histological findings of single session Er:YAG skin fractional resurfacing with various passes and energies and the possible clinical implications.Lasers Surg Med，2008，40(3):171－177.

6 Hantash BM，Bedi VP，Kapadia B，et al.Invito histological evaluation of a novel ablative fractional resurfacing device.Lasers Surg Med，2007，39(2):96－107.

7Hantash BM，Bedi VP，Chan KF，et al.Ex vivo histological characterization of a novel ablative fractional resurfacing device. Lasers Surg Med，2007，39(2):87－95.

(收稿:2013－12－17 修回:2014－03－14)

Effects of Er:YAG laser irradiation on the elastic fibers and collagenic fibers in m ice

SU Ming-ying，PENG Lin-lin，LIU Zhi-li.Dalian Dermatosis Hospital，Dalian，116021

Objective:To determine the effects of Er:YAG laserwith different energies on the changes of elastic fibers and collagenic fibers inmice.Methods:One hundred and twenty-six mice were divided into the high－energy group(75 J/cm2)，low－energy group(43.8 J/cm2)and control group.Hematoxylin and eosin staining and EVG staining were performed to determine the changes of skin after laser irradiation.Results: The elastic fibers，collagenic fibers and the thickness of the dermis in high－energy group were higher than those in other groups，but the time of the erythema edema period was longer.The elastic fibers and collagenic fibers increased quicklywithin amonth after laser irradiation.Conclusion:The elastic fibers and collagenic fibers increased alongwith the increase of laser energy，but the side effect increased accordingly.

Er:YAG laser；elasticity fibers；collagen fibers

大连市皮肤病医院，116021