造血干细胞移植患者人巨细胞病毒监测的临床意义

万华 ，刘川 ，邹叶青 ，石庆芝

(1、南昌市第一医院检验科，江西 南昌330008；2、南昌大学第二附属医院分子医学实验室，血液科，江西 南昌330006)

人巨细胞病毒 (HCMV)在人群中的感染率很高，发达国家约为 60%，在发展中国家，或者某些特殊人群中，感染率超过 95%[1]。HCMV感染是造血干细胞移植受者早期的主要感染并发症及死亡原因,既往因HCMV导致的间质性肺炎病死率高达80%以上。研究资料表明,在HCMV病发生之前,及时使用抗病毒药物治疗,可以有效控制病毒感染，预防和减少HCMV病的发生,降低移植受者的死亡率[2]。因此，HCMV动态监测对HCMV病的早期诊断及抗病毒治疗，降低移植受者的死亡率极为重要。本研究采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法对40例造血干细胞移植术后患者外周血浆HCMV-DNA进行动态定量监测，探讨定量PCR法对HCMV活动性感染的诊断价值及对临床用药的指导意义。

1 材料与方法

1.1 研究对象 2012年1月至2012年12月，南昌大学二附院血液科收治的造血干细胞移植患者40例,其中急性髓系白血病8例、急性淋巴细胞白血病10例、慢性髓系白血病15例、骨髓增生异常综合症7例。所有患者常规进行移植后巨细胞病毒监测,直至停用全部免疫抑制剂。对照组60名来自健康体检人群,各项体检指标均无明显异常。

1.2 实验方法

1.2 .1 DNA提取 无菌操作采集患者EDTA抗凝静脉血5 ml，使用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，然后直接加50μl DNA提取液充分混匀，沸水浴10min,12000r/min离心5 min，取上清液直接用于PCR或-20℃冻存备用。

1.2 .2 HCMV-DNA定量 使用中山大学达安基因有限责任公司提供的HCMV荧光定量试剂盒，选取HCMV保守的序列gH 1202-1407，引物1TGGACCTGGCCAAACGAGCCC 1202-1222，引物2TGGACGAGGCTGCCCATGAGG 1427-1407。在ABI-7500扩增仪进行实时荧光定量PCR，其扩增条件为:93℃预变性 2 min,，93℃变性 45 s，55℃退火 60s，10 个循环；93℃变性 30 s，55℃退火 45s，30个循环。试剂盒提供的阳性标准品 (104~107拷贝/ml)以及阴性对照同时扩增，得出所测样本中的核酸载量值，用基因拷贝/ml表示。每次试验中，阴性对照的Ct值(循环阈值)不显示任何数值，检测下限为 5.0×102拷贝/ml。

1.3 统计处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,计量资料的组间均值比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

实时荧光定量PCR检测结果 real-time PCR共检测40例造血干细胞移植患者416份血标本，其中12例共96份标本阳性，阳性率23.1%(96/416),HCMV 载量介于 5.0×102~1.0×107拷贝/ml之间。对照组阳性率3.3%(2/60),HCMV载量介于5.0×102~1.0×103拷贝/ml之间。移植组与对照组间阳性率差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。

表1 移植组和对照组476份血液标本HCMV-DNA检测结果

3 讨论

HCMV属于疱疹病毒科,是一种特异性的DNA病毒，为已知人类疱疹病毒中最大的一组病毒[3]。HCMV在普通人群中的感染率很高,大多数感染呈临床不显性感染或潜伏感染[4]。造血干细胞移植术后应用免疫抑制剂使机体抵抗力下降，潜伏病毒重新激活，引起HCMV活动性感染，包括HCMV间质性肺炎、肝炎、胃肠炎等。Ruiz等报道，在移植后的第1年里有超过一半的患者会有HCMV原发感染或再激活的实验室证据[5]。所以，建立敏感的HCMV检测方法，及时应用抗病毒治疗，对于预防和减少HCMV病的发生、降低移植受者的死亡率具有重要意义[6]。

Real-time PCR方法具有敏感性高，快速、定量准确的特点。本研究通过real-time PCR方法检测造血干细胞植患者血浆HCMV-DNA，有助于早期、准确的发现HCMV感染，进而对早期HCMV感染的患者进行干预性治疗，使HCMV载量降低并最终转阴，从而降低移植后HCMV病的致死率，提高造血干细胞植患者的长期生存率，具有重要的临床意义。

[1]Griffiths PD,Emery VC,Milne RC.Cytomegalovirus.In:Douglas D,Richmand,Whitley RJ.Clinical Virology[M].3rd ed.ASM Press,2009:475-506.

[2]赵晓甦,刘代红,许兰平,等.异基因造血干细胞移植后巨细胞病毒肺炎临床特点分析[J].北京大学学报(医学版),2009,41(5):548-553.

[3]Munoz-Cobo B,Solano C,Costa E,et al.Dynamics of cytomegalovirus(CMV)plasma DNAemia in initial and recurrent episodes of active CMV infection in the allogeneic stem cell transplantation setting:implications for designing preemptive antiviral therapy strategies[J].Biol Blood Marrow Transplant,2011,17(11):1602-1611.

[4]万华,都莉.免疫低下状态群体感染人巨细胞病毒的研究进展[J].实验与检验医学,2012,30(6):573-575.

[5]Ruiz-Camps I,Len O,de la Camara R,et al.Valganciclovir as preemptive therapy for cytomegalovirus infection in allogeneic haematopoietic stem cell transplant recipients[J].Antivir Ther,2011,16(7):951-957.

[6]Prevention and management of CMV-related problems after hematopoietic stem cell transplantation.[J].Bone Marrow Transplant,2002,29(8):633-638.