黑曲霉固态发酵改善木薯渣品质的研究

汤小朋 赵 华* 汤加勇 王雪涛 贾 刚刘光芒 陈小玲 龙定彪

随着我国畜牧业的大力发展，饲料的需求量也日益增加，而我国又是人口大国，对粮食需求量大，人畜争粮的问题日益突出，畜牧行业面临着饲料资源短缺的严峻考验。为缓解人畜争粮的矛盾，急需开发新的饲料资源［1］。以农副产品废弃物为原料，利用微生物固态发酵(solid-state fermentation，SSF)生产生物饲料逐渐受到人们的重视。Wang 等［2］固态发酵马铃薯渣，Hsu 等［3］固态发酵紫狼尾草与盘固草，Shrivastava等［4］等固态发酵小麦秆等，其发酵后产物的营养价值远远高于发酵前，并大量用于动物饲料中。

木薯原产美洲亚马逊河流域，又名树薯、树翻薯，有“淀粉之王”、“地下粮食”的美誉，与甘薯、马铃薯并称世界三大薯类。我国木薯资源丰富，据联合国粮农组织(FAO)报道，我国2011年木薯产量高达450万t。木薯主要用于提取淀粉及生产酒精，其加工后的木薯渣产量极大。由于木薯渣纤维素含量高，粗蛋白质含量低，还含有较高的氰化物等有毒物质，限制了其在动物尤其是单胃动物生产中的应用［5-6］。因此，目前木薯渣利用率低下，甚至大部分直接丢弃于大自然中，对环境造成了极大的污染。

木薯渣的再利用引起了国内外许多科研工作者极大的兴趣［7-9］，主要集中在对提高木薯渣粗蛋白质含量、降低粗纤维及氰化物含量等方面的研究。但是，许多研究并未考虑微生物的添加量及微生物的安全性，且对影响微生物发酵的因素的优化较少。本研究在总结前人的基础上，对微生物生长有重大影响的氮源、菌液量、发酵时间、发酵温度、水分、pH［10］等先进行单因素优化，然后对发酵时间、发酵温度、料水比、初始pH进行正交试验，筛选出木薯渣最佳的发酵工艺。本研究所用黑曲霉(Aspergillus niger)为中华人民共和国农业部2013年批准允许在饲料中添加的微生物，其最佳发酵条件可为木薯渣等类似低品质的非常规饲料原料的开发与利用提供一些理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种与培养基

发酵菌种:黑曲霉3.287菌株由本实验室保存，每3个月活化1次。

种子活化培养基(PDA):马铃薯(去皮)200 g，切碎，加800 mL水煮沸30 min，8层纱布过滤，加入 20 g葡萄糖，加入 20 g琼脂，加水至1 000 mL，121℃高压灭菌20 min。

发酵培养基:由木薯渣、菜籽粕组成。木薯渣购于广西木薯加工厂，其为提取淀粉后的残渣，粗蛋白质含量为2.96%，粗纤维含量为22.78%;菜籽粕购于四川省雅安市农牧市场，粗蛋白质含量为36.93%，粗纤维含量为 12.27%。

孢子接种液:将黑曲霉接种在固体PDA培养基上培养3～5 d，直至黑曲霉孢子铺满整个培养皿，用20 mL左右的灭菌水冲洗孢子，4层灭菌擦镜纸过滤，采用血球计数板计算黑曲霉孢子悬液浓度，备用。

1.2 单因素试验优化发酵条件

对菌种接种量、菜籽粕添加量、发酵时间、发酵温度、料水比、初始pH 6个因素依次进行单因素试验优化，根据发酵后木薯渣中的羧甲基纤维素酶(CMCase)活性、粗蛋白质和还原糖含量，筛选出最佳的发酵条件。上一轮筛选的最佳因素，作为下一轮因素筛选时的发酵条件。每次发酵结束后，取部分鲜样测定CMCase活性，剩余样品65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定粗蛋白质和还原糖含量。

1.2.1 菌种接种量的优化

木薯渣和菜籽粕按9∶1(m/m)的比例混合配成发酵原料，称取20 g于250 mL三角瓶中，料水比 1∶1.75，121 ℃ 高压灭菌 20 min，然后设置 5 个处理，每个处理每克发酵原料分别接种1×105、5×105、1×106、3×106、5×106个黑曲霉孢子，每个处理3个重复，30℃恒温培养箱发酵4 d。

1.2.2 菜籽粕添加量的优化

设置5个不同比例的菜籽粕添加量(m/m)，分别为 0、5%、10%、15%、20%，每个处理 3个重复。黑曲霉接种量为1.2.1所确定的接种量，其余发酵条件同 1.2.1。

1.2.3 发酵时间的优化

设置 6 个发酵时间点，分别为 2、3、4、5、6、7 d，每个处理3个重复，菜籽粕添加量为 1.2.2所确定的添加量，其余发酵条件同1.2.2。

1.2.4 发酵温度的优化

设置 6 个发酵温度，分别为 27、30、33、36、36℃，每个处理3个重复，发酵时间为1.2.3所确定的时间，其余发酵条件同 1.2.3。

1.2.5 料水比的优化

调节起始料水比(m/V)分别为 1∶1.25、1 ∶1.50、1∶1.75、1∶2.00、1∶2.25，每个处理 3 个重复，发酵温度为1.2.4所确定的温度，其余发酵条件同 1.2.4。

1.2.6 初始 pH 的优化

调节发酵原料初始 pH 分别为 3、4、5、6、7，每个处理3个重复，发酵料水比为1.2.5所确定的比例，其余发酵条件同 1.2.5。

1.3 正交试验优化发酵条件

在单因素试验的基础上，选择发酵时间、发酵温度、料水比、初始pH 4个因素进行4因素3水平的正交设计，进一步优化发酵条件，每组3个重复。发酵结束后，取部分鲜样测定CMCase活性，剩余部分65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定粗蛋白质含量。

1.4 确定最优发酵条件

结合单因素试验设计及正交试验设计确定黑曲霉固态发酵木薯渣的最优条件，以此最优条件发酵木薯渣，设置1个对照组(不接种黑曲霉)，其他条件与试验组一致。每组设3个重复。发酵结束后，取部分鲜样测定滤纸酶、CMCase、β-葡萄糖苷酶活性，剩余部分65℃烘干，粉碎过40目筛，用于测定干物质、粗灰分、粗纤维、粗脂肪、粗蛋白质、还原糖含量。

1.5 指标测定

1.5.1 纤维素酶活性测定

纤维素酶活性测定参照GB/T 23881—2009［11］并有改进。

粗酶液的制备:称取2份2 g左右的湿样，精确至0.000 1 g，一份用于测定风干基础水分含量，另一份加入到150 mL的三角瓶中，精确量取50 mL pH 5.5的柠檬酸缓冲液，40℃，150 r/min摇床1 h，3 800 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液，用于纤维素酶活性的测定。

CMCase活性测定:取3支15 mL具塞玻璃试管，试管1为对照管，试管2、3为试验管。对照管加入 2 mL DNS试剂，试验管加入 2.5 mL pH 5.5羧甲基纤维素钠-柠檬酸缓冲液，3支管依次加入0.5 mL粗酶液，50℃水浴30 min，试验管立即加入2 mL DNS试剂，对照管加入2.5 mL缓冲液。振荡3～5 s，沸水浴5 min。冷却后定容至15 mL，在540 nm处测定吸光度(OD)值。

酶活性定义:在50℃，pH 5.5条件下反应30 min，每分钟降解羟甲基纤维素钠产1μmol还原糖所需的酶量，定义为1个CMCase活性单位，以U/g表示。

滤纸酶活性测定方法同CMCase活性测定，将底物换成1 cm×6 cm新华滤纸。在50℃，pH 5.5条件下反应60 min，每分钟降解滤纸产1μmol还原糖所需的酶量，定义为1个纤维素滤纸酶活性单位，以U/g表示。

β-葡萄糖苷酶活性测定的底物为水杨素，其他同CMCase活性测定。

1.5.2 常规养分及还原糖含量测定

水分、粗灰分、粗脂肪、粗纤维、粗蛋白质含量的测定方法参照张丽英［12］的方法;还原糖含量的测定参照陈毓荃［13］的方法。

1.6 数据分析

数据先用Excel进行整理，再用SPSS 21.0处理、分析。单因素筛选试验数据进行单因素方差分析并结合Duncan氏法进行多重比较;正交试验数据进行极差分析及方差分析。所有试验结果均用平均值±标准差表示，显著水平为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 黑曲霉接种量对木薯渣营养价值的影响

从表1中可以看出，随着菌种接种量的增加，CMCase活性逐渐增加，当接种量为3×106个/g时，CMCase活性最高，达到6.21 U/g;然后随着接种量的增加，CMCase活性又降低。粗蛋白质含量变化趋势和CMCase活性相同，当接种量为3×106个/g时，粗蛋白质含量最高，达到8.79%。接种量为 1×106个/g时，还原糖含量最高，达到8.49%;当接种量为3×106个/g时，还原糖含量最低，只有6.60%，可能是因为CMCase分解产生的还原糖被黑曲霉利用的比其他组要多。因此，选择3×106个/g的接种量作为最佳的菌种接种量。

表1 黑曲霉接种量对木薯渣营养价值的影响(风干基础)Table 1 Effects of Aspergillus niger inoculation size on nutritional value of cassava residue(air-dry basis)

2.1.2 菜籽粕添加量对木薯渣营养价值的影响

从表2中可以看出，随着菜籽粕添加量的增加CMCase活性逐渐增加，添加20%菜籽粕时CMCase活性最高，达到10.54 U/g，但与添加15%菜籽粕组相比差异不显著(P＞0.05);添加15%菜籽粕组粗蛋白质含量提高量最高，达到45.90%;添加15%菜籽粕组还原糖含量最低，为1.84%，显著低于其他组(P＜0.05)。这说明添加15%菜籽粕时，木薯渣发酵效果最好。

2.1.3 发酵时间对木薯渣营养价值的影响

从表3中可以看出，发酵3 d时CMCase活性最高，达到11.25 U/g，随后逐渐降低;粗蛋白质含量逐渐增加，到4 d时达到最高，为12.16%，随后逐渐降低;还原糖含量均较低。因此，发酵时间选择为 3～4 d。

表2 菜籽粕添加量对木薯渣营养价值的影响(风干基础)Table 2 Effects of rapeseed meal supplemental level on nutritional value of cassava residue(air-dry basis)

表3 发酵时间对木薯渣营养价值的影响(风干基础)Table 3 Effects of fermentation time on nutritional value of cassava residue(air-dry basis)

2.1.4 发酵温度对木薯渣营养价值的影响

从表4中可以看出，CMCase活性只有27℃组与36℃组差异显著(P＜0.05)，且36℃组CMCase活性最高，为7.21 U/g;粗蛋白质含量随着温度升高而增加，36℃时达到最高，为11.02%，随后逐渐降低;还原糖含量随温度升高逐渐降低，其中36℃组略高于33℃组。因此发酵温度可选择在33～36℃之间。

表4 发酵温度对木薯渣营养价值的影响(风干基础)Table 4 Effects of fermentation temperature on nutritional value of cassava residue(air-dry basis)

2.1.5 料水比对木薯渣营养价值的影响

水分是影响微生物发酵的重要因素之一，过低会影响微生物对营养物质的吸收，过高会影响培养基的通透性，不利于微生物的生长。从表5中可以看出，CMCase活性随着底物水分的增多而增加，料水比为 1∶1.75 时最高，为 6.60 U/g，略高于料水比 1∶1.50 组，但差异不显著(P＞0.05);粗蛋白质含量随着水分的增加而逐渐增加，料水比1∶2.00时达到 11.38%，随后逐渐降低，料水比1 ∶1.50组和 1∶1.75 组差异不显著(P＞0.05);还原糖含量最高组为 1∶1.50 组，为 10.95%。考虑到发酵物的烘干成本，选择料水比为1∶1.50。

表5 料水比对木薯渣营养价值的影响(风干基础)Table 5 Effects of the ratio of substrate to moisture on nutritional value of cassava residue(air-dry basis)

2.1.6 初始pH对木薯渣营养价值的影响

酸碱度也是影响微生物生长的重要因素之一。从表6中可以看出，随着pH的升高，CMCase活性逐渐降低，pH 6时达到最低，但pH 7时又升高。pH 3时 CMCase活性最高，为 6.55 U/g，略高于pH 4组，且差异不显著(P＞0.05)，但显著高于其他组(P＜0.05);粗蛋白质含量随着pH升高而增加，pH 4时，达到最高，为 11.68%，随后逐渐降低，pH 7时又升高。还原糖含量pH 4组最低，pH 3组略高于pH 4组。因此，发酵时可选择初始pH为3～4。

表6 初始p H对木薯渣营养价值的影响(风干基础)Table 6 Effects of initial pH on nutritional value of cassava residue(air-dry basis)

由单因素试验可得黑曲霉3.287固态发酵木薯渣最佳条件为:接种量5×106个/g发酵原料，菜籽粕添加量15%，发酵时间3～4 d，发酵温度33～36 ℃，料水比 1∶1.50，初始 pH 3～4。

2.2 正交试验结果

采用L9(34)正交试验设计，考察发酵时间、发酵温度、料水比、初始pH对木薯渣发酵粗蛋白质含量的影响。各因素水平分别为:发酵时间(3.0、3.5、4.0 d)，发酵温度(33.0、34.5、36.0 ℃)，料水比(1∶1.50、1∶1.75、1∶2.00)，初始 pH(3、4、5)，分别用A、B、C、D表示。由极差分析(表7)CMCase活性可知，影响试验结果因素的先后顺序为:A＞C＞D＞B，即影响木薯渣发酵产CMCase的因素依次为发酵时间、料水比、初始 pH、发酵温度。由CMCase的K值可得最佳组合为A2B1C3D2，即发酵时间 3.5 d，发酵温度 33.0 ℃，料水比 1∶2.00，初始pH 4。由粗蛋白质的R值可知，影响试验结果因素的先后顺序为:A＞C＞D＞B，即影响木薯渣粗蛋白质含量的因素依次为发酵时间、料水比、初始pH、发酵温度。由粗蛋白质的K值可得最佳发酵组 合 A3B3C1D2，即 发 酵 时 间 4.0 d，发 酵 温 度36.0 ℃，料水比 1∶1.50，初始 pH 4。结合单因素试验得到木薯渣发酵的最佳条件:接种量3×106个/g发酵原料，菜籽粕添加量15%，发酵时间4 d，发酵温度 36 ℃，料水比 1∶1.50，初始 pH 4。

2.3 最优条件发酵结果

从表8中可以看出，以最优条件发酵木薯渣后，CMCase、滤纸酶、β-葡萄糖苷酶活性分别达到9.05、2.37、2.35 U/g。与对照组相比，以干物质为基础，粗灰分含量由 6.02%提高到 7.31%(P＜0.05)，粗蛋白质含量由 8.67%提高到 13.48%(P＜0.05)，粗脂肪含量由 7.89%提高到 11.72%(P＜0.05)，还原糖含量由 1.42%提高到 5.11%(P＜0.05)，粗纤维含量由 22.26%降低到 17.71%(P＜0.05)。

3 讨论

不同的微生物产酶的种类和产酶能力不同，在选择用微生物固态发酵改善农副产品废弃物品质时，菌种的选择就显得尤为重要，常常要根据发酵目的不同来选择不同的微生物进行发酵［10］。与此同时，培养基成分、培养基粒度、微生物接种量、发酵时间、发酵温度、水分含量、pH等因素也对发酵效果有着重要的影响［10，14］。

表7 正交试验结果的极差分析表Table 7 The range analysis table of orthogonal test results

表8 黑曲霉发酵后木薯渣营养成分变化(干物质基础)Table 8 The change of nutrients of fermented cassava residue by Aspergillus niger(DM basis)

微生物接种量和发酵时间对发酵底物有较大的影响，本试验最佳的黑曲霉接种量和发酵时间为3×106个/g和4 d，粗蛋白质含量提高到了13.48%。接种量主要影响发酵的快慢，接种量过低，微生物生长缓慢，杂菌感染的几率增加，发酵延长。接种量过高，微生物生长迅速，在短时间积累大量的代谢产物副产物，抑制微生物活性物质的合成。因此，在发酵过程中要选择合适的微生物接种量，这样可以缩短发酵时间，提高经济效益。

木薯渣中粗蛋白质含量低，在发酵过程中其不足以提供微生物生长所需的氮，因此在试验过程中需添加额外的氮源，其中主要是无机氮和有机氮2种形式［14-16］。无机氮源主要以尿素、铵盐等为主，有机氮源主要以含蛋白质较高的菜籽粕、豆粕、面粉等为主。Tijani等［14］以小麦面粉为氮源，用白腐真菌发酵木薯皮，发现添加小麦面粉4.30%(m/m)时，木薯皮发酵效果最好，粗蛋白质含量提高77.83%，木质素含量降低52.62%。艾必燕等［16］添加20%的豆粕时，粗蛋白质含量最高，为18.6%。本研究以菜籽粕作为氮源，添加量为15%时，粗蛋白质含量提高最高，为45.90%，最佳条件发酵后粗蛋白质含量为13.48%(干物质基础)。粗蛋白质提高量低于Tijani等［14］，粗蛋白质含量低于 Kaewwongsa等［15］及艾必燕等［16］。这可能主要是由于所用氮源不同，底物粗蛋白质含量不同造成的。

pH会影响微生物的生长和代谢产物的合成，黑曲霉产纤维素酶分解底物时一般在酸性或中性偏酸环境中。Sohail等［17］研究温度、pH对黑曲霉MS82产纤维素酶的影响，在pH为4，温度为35℃条件下纤维素酶活性最高，这与本研究筛选的最适pH 4条件一致。高星星［18］研究表明pH 5时，里氏木霉和黑曲霉混合发酵产酶效果最好，其最适pH高于本研究，这可能是由于其采用的是复合菌种发酵，且发酵底物不同等原因造成。

在固态发酵中，水分对微生物的产酶能力起着重要作用，它影响微生物的生长及活性，进而影响微生物产酶性能［19］。Jamal等［10］利用响应面法考察pH、接种量、水分对白腐真菌发酵木薯皮的影响，结果发现 pH 5.3、水分 70%(V/m)、接种量6%(V/m)时木质素含量降低达到50.62%，其中水分对发酵的影响极显著。其结果与本研究水分对木薯渣发酵的影响一致，但其水分添加量略高于本研究的添加量。管军军等［20］混菌发酵木薯渣，其中水分添加量为60%发酵效果最好，与本研究相同。

温度影响微生物的生长和次级代谢物的产生，真菌在20～55℃范围内都能生长，但在不同的温度下其合成的有机物不同，因此要根据发酵的目的选择合适的温度［21］。本研究的目的是利用黑曲霉发酵降解木薯渣纤维素，提高粗蛋白质含量，本研究发现36℃时CMCase活性及粗蛋白质含量最高，与 Sohail等［17］、刘传都［22］的温度条件基本一致。

Okpako等［9］用黑曲霉和鼠李糖杆菌发酵木薯皮渣，水分含量由7.50%提高到10.34%，粗灰分含量由 6.50%提高到 7.52%，粗蛋白质含量由5.50%提高到24.40%，这些变化趋势与本研究相同，粗蛋白质提高量高于本研究;但其粗纤维含量由发酵前的4.62%提高到发酵后的10.62%，与本研究粗纤维含量变化趋势相反。Aro等［23］对木薯废渣的2种形式——木薯淀粉残渣(CSR)和木薯皮(CAP)分别进行微生物发酵研究，CSR的粗蛋白质含量由发酵前的1.12%增加到发酵后的7.02%，粗纤维含量由发酵前的19.20%下降到12.06%;CAP的粗蛋白质含量由发酵前的5.30%增加到10.94%，粗纤维含量由发酵前的 38.44%下降到5.88%，与本研究粗蛋白质、粗纤维含量变化一致。微生物在发酵过程中，利用菜籽粕和木薯渣提供的氮源和碳源进行繁殖、生长，消耗部分底物，导致底物干物质含量降低。黑曲霉分泌纤维素酶、淀粉酶等物质，它们分解木薯渣中的纤维素、淀粉等碳水化合物，导致粗纤维含量降低。碳水化合物被黑曲霉分解利用，部分以二氧化碳形式排出，同时微生物在利用菜籽粕中氮源的同时提高自身的菌体蛋白含量，导致干物质含量降低，从而使粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分含量相对提高，但其绝对含量保持不变或略有降低［24］。粗脂肪含量提高还可能由于黑曲霉能利用碳水化合物合成脂肪。虽然木薯渣粗蛋白质绝对含量不变，但是在微生物发酵过程中累积大量营养丰富的菌体蛋白及许多微生物代谢产物，使木薯渣营养价值得到改善。

4 结论

①通过单因素试验与正交试验得到黑曲霉3.287发酵木薯渣的最优条件为:接种量 3×106个/g发酵原料、菜籽粕添加量15%、发酵时间4 d、发酵温度 36 ℃、料水比 1∶1.50、初始 pH 4。

② 以最优条件发酵木薯渣后，CMCase活性达到 9.05 U/g，滤纸酶活性达到 2.27 U/g，β-葡萄糖苷酶活性到2.35 U/g。与对照组相比，以干物质为基础，粗灰分含量由6.02%提高到7.31%，粗蛋白质含量由8.67%提高到13.48%，粗脂肪含量由7.89%提高到 11.72%，还原糖含量由 1.42%提高到 5.11%，粗纤维含量由 22.26%降低到17.71%。

［1］ ARORA D S，SHARMA R K，CHANDRA P.Biodel-ignification of wheat straw and its effect on in vitro digestibility and antioxidant properties［J］.International Biodeterioration and Biodegradation，2011，65(2):352-358.

［2］ WANG T Y，WU Y H，JIANG C Y，et al.Solid state fermented potato pulp can be used as poultry feed［J］.British Poultry Science，2010，51(2):229-234.

［3］ HSU PK，LIU C P，LIU L Y，et al.Protein enrichment and digestion improvement of napiergrass and pangolagrass with solid-state fermentation［J］.Journal of Microbiology，Immunology，and Infection，2013，46(3):171-179.

［4］ SHRIVASTAVA B，NANDAL P，SHARMA A，et al.Solid state bioconversion of wheat straw into digestible and nutritive ruminant feed by Ganoderma sp.rckk02［J］.Bioresource Technology，2012，107:347-351.

［5］ UBALUA A O.Cassava wastes:treatment options and value addition alternatives［J］.African Journal of Biotechnology，2007，6(18):2065-2073.

［6］ ARO S O.Improvement in the nutritive quality of cassava and its by-products through microbial fermentation［J］.African Journal of Biotechnology，2008，7(25):4789-4797.

［7］ OBOH G，AKINDAHUNSI A A，OSHODI A A.Nutrient and anti-nutrient contents of Aspergillus niger and fermented cassava products(flour and gari)［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2002，15(5):617-622.

［8］ OBOH G.Nutrient enrichment of cassava peels using a mixed culture of Saccharomyces cerevisae and Lactobacillus spp.solid media fermentation techniques［J］.Electronic Journal of Biotechnology，2006，9(1):46-49.

［9］ OKPOKO C E，NTUI V O，OSUAGWU A N，et al.Proximate composition and cyanide content of cassava peels fermented with Aspergillus niger and Lactobacillus rhamnosus［J］.Journal of Food，Agriculture ＆ Environment，2008，6(2):251-255.

［10］ JAMAL P，TIJANI R I D，ALAM M Z，et al.Effect of operational parameters on solid state fermentation of cassava peel to an enriched animal feed［J］.Journal of Applied Sciences，2012，12(11):1166-1170.

［11］ 全国饲料工业标准化技术委员会.GB/T 23881—2009饲用纤维素酶活性的测定——滤纸法［S］.北京:中国标准出版社，2009.

［12］ 张丽英.饲料分析及饲料质量检测技术［M］.3版.北京:中国农业大学出版社，2007:49-79.

［13］ 陈毓荃.生物化学实验方法和技术［M］.北京:科学出版社，2002:97-100.

［14］ TIJANI I D R，JAMAL P，ALAM M Z，et al.Optimization of cassava peel medium to an enriched animal feed by the white rot fungi Panus tigrinus M609RQY［J］.International Food Research Journal，2012，19(2):427-432.

［15］ KAEWWONGSA W，TRAIYAKUN S，YUANGKLANG C，et al.Protein enrichment of cassava pulp fermentation by Saccharomyces cervevisiae［J］.Journal of Animal and Veterinary Advances，2011，10(18):2434-2440.

［16］ 艾必燕，刘长忠，陈建康，等.木薯渣发酵饲料的工艺筛选［J］.饲料工业，2012，33(7):57-60.

［17］ SOHAIL M，SIDDIQI R，AHMAD A，et al.Cellulase production from Aspergillus niger MS82:effect of temperature and pH［J］.New Biotechnology，2009，25(6):437-441.

［18］ 高星星.里氏木霉与黑曲霉混合发酵产纤维素酶的研究［D］.硕士学位论文.合肥:合肥工业大学，2012:29.

［19］ BHATTACHARYA S S，GARLAPATI V K，BANERJEE R.Optimization of laccase production using response surface methodology coupled with differential evolution［J］.New Biotechnology，2011，28(1):31-39.

［20］ 管军军，张同斌，崔九红，等.木薯渣生产菌体蛋白的研究［J］.安徽农业科学，2008，36(22):9556-9558，9596.

［21］ BHARGAV S，PANDA B P，ALI M，et al.Solid state fermentation:an overview［J］.Chemical＆ Biochemical Engineering Quarterly，2008，22(1):49-70.

［22］ 刘传都.利用混合菌固体发酵木薯渣生产菌体蛋白饲料的研究［D］.硕士学位论文.武汉:华中农业大学，2009:20-21.

［23］ ARO S O，ALETOR V A.Proximate composition and amino acid profile of differently fermented cassava tuber wastes collected from a cassava starch producing factory in Nigeria［J/OL］.Livestock Research for Rural Development，2012，24(3):［2012-03-04］.http://www.lrrd.org/lrrd24/3/aro24040.htm.

［24］ 陈中平，周安国，王之盛，等.米曲霉发酵豆粕营养特性的研究［J］.中国畜牧杂志，2011，47(9):40-44.