α－亚麻酸对瘤胃微生物体外发酵特性及其生物氢化中间产物的影响

周 薇 徐方华 陈 娜 高青山 李香子

(延边大学农学院，延吉 133000)

α－亚麻酸(c9，c12，c15-C18∶3，Lna)是一种广泛存在于天然牧草中含有3个双键的十八碳(C18)长链不饱和脂肪酸［1］。Harfoot等［2］研究发现，α－亚麻酸在瘤胃微生物的生物加氢作用下还原生成反11，顺15－亚油酸(t11，c15-C18∶2)，通过进一步生物加氢还原为反11－油酸(t11-C18∶1)和硬脂酸(C18∶0)等代谢产物。Polan等［3］和 Garton［4］通过体外试验验证了 Harfoot等［2］的结果，发现α－亚麻酸氢化过程中会形成顺9，反11－共轭亚油酸(c9，t11-CLA)和 t11-C18∶1 等中间产物，现在这种氢化路径被广泛接受。Abughazaleh等［5］和 Jenkins等［6］研究发现，t11-C18∶1 氢化过程中不仅可以形成C18∶0，也可以通过双键异构化作用形成反9－油酸(t9-C18∶1)，且这种异构化作用受瘤胃液pH变化的影响。Zheng等［7］通过在奶牛饲粮中添加豆油推测出亚麻酸(C18∶3)可以增加十二指肠中t11-C18∶1含量，并进一步增加牛乳中c9，t11-CLA 含量。Wu等［8］研究发现，饲粮高水平的亚油酸(C18∶2)会降低瘤胃中C18∶0含量，增加单烯脂肪酸的累积，但Avila等［9］研究认为，增加脂肪的添加可以提高氢化率。二者结果的差异可能是脂肪酸种类及添加水平差别造成的［10］，脂肪酸水平对氢化作用及机理有待研究。除此之外，饲粮精粗比也可以影响氢化率，高精饲粮与低精饲粮相比可以显著降低n6亚油酸(C18∶2 n6)及 α－亚麻酸的氢化率［10］。

共轭亚油酸(CLA)对人体有很重要的健康意义，如抗癌、减轻动脉硬化、减肥、增强免疫力等［11－12］。目前关于亚麻酸氢化过程是否生成CLA说法不一。Wasowska等［13］通过在体外发酵试验中添加亚麻酸发现经过生物氢化后可以形成2种亚麻酸异构体，但没有c9，t11-CLA的累积。而Choi等［14］通过在模拟人工瘤胃中对比发现，添加亚麻酸对总CLA的增加趋势比添加亚油酸更显著。因此，确定亚麻酸等n-3不饱和脂肪酸在氢化过程中是否形成CLA异构体是特别重要的。有研究发现，与CLA相比，共轭亚麻酸(CLnA)对肿瘤细胞有更强的毒性［15］，但有关α－亚麻酸代谢生成CLnA的相关报道还很少。本试验研究了α－亚麻酸对瘤胃体外发酵特性及生物氢化中间产物的影响，以期明确瘤胃内α－亚麻酸氢化及代谢过程，为确定CLA及CLnA产生途径提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物及瘤胃液采集

选择4头体重为(350±12)kg安装有永久性瘤胃瘘管的成年健康延边黄牛，以供瘤胃液的采集。试验动物每天饲喂2次(07:30和18:00)，自由饮水。基础饲粮精粗比为60∶40，其组成及营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(DM basis) %

1.2 试验设计

根据培养底物中α－亚麻酸添加水平的不同，分为4组，设添加水平分别为0(对照组，CON组)、1.5%(低添加水平组，LL 组)、3.0%(中添加水平组，ML 组)、4.5%(高添加水平组，HL 组)，每组设3个重复。

1.3 培养方法

采用体外批次培养法，培养底物组成与瘤胃液供体牛基础饲粮组成完全相同。在晨饲2 h后，从4头牛瘤胃内背囊、背盲囊、腹囊、腹盲囊不同位点采集足量瘤胃内容物，在混合后依次通过4层和12层纱布过滤，收集在经过预热的保温瓶内，恒温39℃，通入饱和二氧化碳。将培养底物粉碎过筛混合均匀，取2 g加入培养瓶内;加入瘤胃液及缓冲液(配制参考M cDougall［16］的方法)各45 m L。在培养瓶内加入乳化后的α－亚麻酸(美国Sigma公司)，通入饱和二氧化碳，用胶塞及铝盖密封放入恒温振荡培养箱内培养12 h(135 r/m in，39 ℃)。

1.4 测定指标及方法

在培养3、6和12 h分别取体外培养液1 m L用靛酚比色法测定氨态氮含量。使用安捷伦气相色谱仪(GC－7890A)采用外标法测定挥发性脂肪酸(VFA)浓度，火焰离子检测器(FID)，进样温度170℃，柱温120℃，检测器温度200℃，毛细管柱为 Agilent 19091F－112(25 m×320 μm×0.5 μm)。用雷磁pHS－3C pH计测定培养液pH。在培养瓶内加入1m L内标溶液［1 g十三碳酸(C13∶0，美国Sigma公司)用氯仿定容至100 m L］、30 m L脂肪提取液(氯仿∶甲醇体积比为2∶1);培养液内脂肪提取参照Folch等［17］的方法;脂肪酸甲基化参照Lepage等［18］的方法;脂肪酸含量使用安捷伦气相色谱仪(GC－7890A)测定，配备100 m石英毛细管柱(Supelco SPTM－2560，0.25 mm)。进样口和检测器温度分别为 240、250℃;分流比 1∶100;柱箱温度140℃，持续2 m in，增至240℃，速度为4℃/m in，并保持40 m in。CLA异构体采用c9，t11-CLA(91396，Fluka，美国)、反 10，顺 12－共轭亚油酸(t10，c12-CLA)(美国 Fluka公司)标准品进行定量分析;其他脂肪酸标准品均购自美国Supelco公司。顺 9，反 11，顺15－共轭亚麻酸(c9，t11，c15-CLnA，75%)标准品由 Chouinard教授(STELA:INAF-UniversitéLaval，加拿大)赠送。

1.5 数据处理与统计分析

数据处理采用Excel 2007，分析采用 SPSS 17.0中的one-way ANOVA程序进行方差分析，多重比较采用Duncan氏法进行。数据以平均值±标准误表示。

2 结果

2.1 α－亚麻酸对瘤胃体外发酵特性的影响

由表2可见，随培养时间延长，各组培养液pH均降低，氨态氮含量及总挥发性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸浓度均增加。同一时间点，pH随α－亚麻酸添加水平增加而降低，但组间差异均不显著(P＞0.05)。在3和6 h，ML组和 HL组氨态氮含量显著或极显著低于CON组(P＜0.05或P＜0.01)。ML组和HL组TVFA浓度在3 h时极显著低于CON组和 LL组(P＜0.01)，HL组在6和12 h时显著或极显著低于其他各组(P＜0.05或P＜0.01)。HL组乙酸浓度在各时间点显著或极显著低于其他各组(P＜0.05或 P＜0.01)。HL 组丙酸浓度在3 h显著低于其他各组(P＜0.05)，CON组和HL组在6 h时极显著低于ML组和LL组(P＜0.01)，CON组在12 h显著或极显著低于其他各组(P＜0.05或 P＜0.01)。ML 组和 HL 组丁酸浓度均极显著低于CON组和LL组(P＜0.01)。LL组乙酸/丙酸在3 h时显著低于其他各组(P＜0.05)，ML组和HL组在6和12 h时间显著或极显著低于 CON 组和 LL 组(P＜0.05 或 P＜0.01)。

2.2 α－亚麻酸对瘤胃体外发酵培养液 C 18脂肪酸含量的影响

由表3可知，随培养时间延长，C18∶0含量随培养时间延长缓慢增加;LL组及HL组t11-C18∶1含量增加，CON组及ML组在3～6 h升高，随后下降;LL组和ML组 t9-C18∶1含量不断增加，CON组和 HL组 t9-C18∶1含量逐渐下降，ML组c9-C18∶1含量逐渐升高，HL组先升高，在培养6 h后下降，CON组和LL组均逐渐降低;CON组2种共轭亚油酸(c9，t11-CLA和t10，c12-CLA)变化幅度较小，LL组和ML组均逐渐降低，HL组c9，t11-CLA含量逐渐降低，而t10，c12-CLA含量先降低，在6 h以后略有升高;CON组和LL组顺9，顺12－亚油酸(c9，c12-C18∶2)含量逐渐下降，其余 2组逐渐升高;CON组及 HL组反 9，反 12－亚油酸(t9，t12-C18∶2)含量不断减少，其他2组先降低，再升高;CON 组未检测到 t11，c15-C18∶2、c9，t11，c15-CLnA 和顺9，反 13，顺 15－共轭亚麻酸(c9，t13，c15-CLnA)，HL 组 c9，t11，c15-CLnA 含量先降低再增加，c9，t13，c15-CLnA含量变化与之相反，LL组和ML组这2种CLnA含量均逐渐降低;ML组和HL组α－亚麻酸含量逐渐升高，LL组逐渐降低，CON组变化幅度较小;γ－亚麻酸(C18∶3 n6)含量变化幅度较小;LL组和HL组总CLA含量逐渐降低，ML组先降低，后略有升高;LL组和ML组总CLnA含量逐渐降低，HL组先降低，后升高。

同一时间点，组间比较:试验组C18∶0含量均极显著低于CON组(P＜0.01)，且试验组间差异不显著(P＞0.05);LL 组油酸(t11-C18∶1、t9-C18∶1、c9-C18∶1)含量均显著或极显著高于其他各组(P＜0.05或 P＜0.01);ML 组和 HL 组 c9，t11-CLA 含量在3和6 h极显著高于其他各组(P＜0.01)，ML组在12 h极显著高于其他各组(P＜0.01);试验组t10，c12-CLA含量均极显著高于 CON组(P＜0.01)，LL组在 3 h极显著高于 ML组和 HL组(P＜0.01)，6 h 时试验组间差异不显著(P＞0.05)，ML组和 HL组在12 h时显著高于 LL组(P＜0.05);LL 组亚油酸(时间点 t9，t12-C18∶2 和 3 和6 h时的c9，c12-C18∶2)含量均极显著高于其他各组(P＜0.01);HL 组 CLnA(各时间点 c9，t11，c15-CLnA和3和6 h时 c9，t13，c15-CLnA)含量均极显著高于其他各组(P＜0.01);亚麻酸(α－亚麻酸和γ－亚麻酸)含量总体上为ML组较高;总CLA含量3 h时为ML组显著或极显著高于其他各组(P＜0.05或 P＜0.01)，6 h 时 HL 组极显著高于其他各组(P＜0.01)，12 h时 ML组和 HL组极显著高于其他各组(P＜0.01);总 CLnA含量均为 HL组极显著高于其他各组(P＜0.01)，ML组极显著 高于 LL组和 CON 组(P＜0.01)。

表2 α－亚麻酸对瘤胃体外发酵特性的影响Table 2 Effects ofα-linolenic acid on in vitro rum inal fermentation characteristics

表3 α－亚麻酸对瘤胃体外发酵培养液C18脂肪酸含量的影响Table 3 Effects ofα-linolenic acid on C18 fatty acid contents in culturemedium after in vitro rum inal fermentation mg/dL

续表3

3 讨论

α－亚麻酸的添加显著改变了瘤胃发酵模式，降低乙酸和丁酸浓度，提高了丙酸浓度，进而降低乙酸/丙酸，并减少了氨态氮生成，这与张春梅等［19］和 Zhang 等［20］的研究相符，刘亮［21］在人工瘤胃试验中添加亚麻酸也得到相同效果。本试验中，培养液pH随α－亚麻酸添加水平增加而下降，这与魏宏阳等［22］的研究不相符合。魏宏阳等［22］认为，VFA浓度减少会导致瘤胃液pH上升。周倩等［23］研究中发现，随添加不饱和油脂不饱和度的增加，瘤胃液pH有降低趋势。本试验发现，游离不饱和脂肪酸在低浓度下，减少了TVFA浓度，但影响不显著，同时的确可以使pH在一定程度上上升。但当添加高水平α－亚麻酸时，pH产生一定程度的下降，可能是由于高水平α－亚麻酸使瘤胃内菌群发生了变化，其具体原因有待进一步研究。

在本试验中，C18∶0随培养时间延长累积增加，但与α－亚麻酸添加水平变化趋势相反，这可能是α－亚麻酸在氢化过程中形成顺9，反12－亚油酸(c9，t12-C18∶2)、CLnA 及 CLA 累积在培养液内，一定程度上阻止了t11-C18∶1氢化为C18∶0造成的。Song等［24］在研究中发现，游离的亚油酸可以阻止 t11-C18∶1及 t9-C18∶1完成氢化过程。而培养过程中，t9-C18∶1 及 c9-C18∶1 的累积，也与pH的变化有关。AbuGhazaleh等［5］研究发现，当培养液pH低于6.5时，油酸的双键会出现在＜C10的位置上。Kim等［25］发现，只有在培养液中的亚油酸含量足够抑制生物氢化作用，CLA含量才会显著增加。正是因为这种抑制作用会同时生成CLA和反式油酸。本试验中，培养3 h时，培养液中c9，c12-C18∶2含量随α－亚麻酸添加水平增加而减少，而可能是由于高水平的α－亚麻酸促进c9，c12-C18∶2 生成 c9，t11-CLA。本试验中，c9，t11-CLA含量随α－亚麻酸添加水平升高而增加，二者间存在剂量效应关系。培养6 h时，c9，c12-C18∶2逐渐消耗，由生成CLA转而偏向生成反式油酸，因此培养液中反式油酸含量增加，而CLA变化趋势相对平缓。培养12 h时，LL组及HL组仍偏向于生成反式油酸，而ML组则偏向于生成CLA。LL组t9，t12-C18∶2随在培养过程中大量累积，说明低水平的α－亚麻酸可能会使反式亚油酸大量累积。而ML组、HL组 t9，t12-C18∶2含量较低并随培养过程无变化或降低，可能是高水平不饱和脂肪酸促进了氢化的进行，并使一部分反式亚油酸转化为亚油酸，这也就解释了ML组和HL组亚油酸随时间延长含量增加的现象。Hughes等［26］通过分离和鉴定溶纤维丁酸弧菌，证实了pH中性时c9，t11-C18∶2还原酶的活性最大。本试验中，CON组在各时间点均未检测到2种CLnA及t11，c15-C18∶2，说明了 α－亚麻酸的氢化过程只有在高于一定水平后才会发生。在瘤胃内，α－亚麻酸异构为c9，t11，c15-CLnA，进而通过加氢作用转化为 t11，c15-C18∶2［2，27－28］。本试验中，M L、HL 组t11，c15-C18∶2在各培养时间点与CON组比均有显著增加，LL组随培养时间增加含量不断降低，这可能是由于其异构化的作用。而ML组及HL组在3 h之后含量不断累积，可能是由于培养液pH下降低于了6.2(表2)，抑制了异构酶和氢化酶的作用。有研究表明，当pH低于6.0时包括溶纤维素丁酸弧菌和白色瘤胃球菌在内的纤维素分解菌的生长繁殖会受到抑制，而这些纤维素分解菌也是参与氢化及异构反应的主要微生物［1，29］，随后的 c9，t11，c15-CLnA 和 t11，c15-C18∶2 含量变化趋势与之类似。总CLnA含量随α－亚麻酸添加水平的上升而增加，说明其二者之间存在一定剂量效应关系。6 h之后总CLnA及总CLA含量随培养时间延长消失速度变慢，进一步证实了pH低于6.0使得氢化微生物繁殖受到抑制，氢化过程减慢，进而使CLA及CLnA在培养液中累积。

4 结论

饲粮中添加α－亚麻酸可以改变瘤胃发酵模式，产生多种油酸异构体，促进瘤胃内 t11，c15-C18∶2、CLA和CLnA的累积，且总 CLnA 与 α－亚麻酸存在剂量效应关系。

［1］ LOURENCO M，RAMOS-MORALES E，WALLACE R J.The role of m icrobes in rumen lipolysis and biohydrogenation and their manipulation［J］.Animal，2010，4(7):1008－1023.

［2］ HAFOOT C G，HAZLEWOOD G P.Lipidmetabolism in the rumen［M］//HOBSON P N.The rumen m icrobial ecosystem.Netherlands:Springer，1998:382－426.

［3］ POLAN C E，MCNEILL JJ，TOVE C B.Biohydrogenation of unsaturated fatty acids by rumen bacteria［J］.Journal of Bacteriology，1964，88(4):1056－1064.

［4］ GARTON G A.Fatty acid metabolism in rum inants［J］.Biochem istry of Lipids，1977，14:337－370.

［5］ ABUGHAZALEH A A，RILEY M B，THIES E E，et al.Dilution rate and pH effects on the conversion of oleic acid to trans C18∶1 positional isomers in continuous culture［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(12):4334－4341.

［6］ JENKINS T C，ABUGHAZALEH A A，FREEMAN S，et al.The production of 10-hydroxystearic and 10-ketostearic acids is an alternative route of oleic acid transformation by the rum inalm icrobiota in cattle［J］.The Journal of Nutrition，2006，136(4):926－931.

［7］ ZHENG H C，LIU JX，YAO JH，etal.Effects of dietary sources of vegetable oils on performance of highyielding lactating cow s and conjugated linoleic acids m ilk［J］.Journal of Dairy Science，2005，88(6):2037－2042.

［8］ WU Z，OHAJURUKA O A，PALMQUIST D L.Rum inal synthesis，biohydrogenation，and digestibility of fatty acids by dairy cows［J］.Journal of Dairy Science，1991，74(9):3025－3034.

［9］ AVILA C D，DEPETERS E J，PEREZ-MONTIH，et al.Influences of saturation ratio of supplemental dietary fat on digestion and m ilk yield in dairy cow s［J］.Journal of Dairy Science，2000，83(7):1505－1519.

［10］ 孙攀峰，姚建红，刘建新.瘤胃十八碳不饱和脂肪酸氢化的研究进展［J］.动物营养学报，2007，19(增刊):508－514.

［11］ PARK Y，STORKSON JM，ALBRIGHT K J，et al.Evidence that the trans-10，cis-12 isomer of conjugated linoleic acid induces body com position changes in m ice［J］.Lipids，1999，34(3):235－241.

［12］ AZAIN M J，HAUSMAN D B，SISK M B，et al.Dietary conjugated linoleic acid reduces rat adipose tissue cell size rather than cell number［J］.The Journal of Nutrition，2000，130(6):1548－1554.

［13］ IGARASHIM，M IYAZAWA T.New ly recognized cytotoxic effect of conjugated trienoic fatty acids on cultured human tumor cells［J］.Cancer Letters，2000，148(1):173－179.

［14］ WASOWSKA I，MAIA M R G，NIEDZW IEDZKA K M，etal.Influence of fish oil on rum inal biohydrogenation of C18 unsaturated fatty acids［J］.British Journal of Nutrition，2006，95(6):1199－1211.

［15］ CHOISH，SONG M K.Effectof C18-polyunsaturated fatty acids on their direct incorporation into the rumen bacterial lipids and CLA production in vitro［J］.Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2005，18(4):1011－2367.

［16］ MCDOUGALL E I.Studies on rum inant saliva.1.The composition and output of sheep’s saliva［J］.Biochem ical Journal，1948，43(1):99－109.

［17］ FOLCH J，LEES M，SLOANE STANLEY G H.A sim plemethod for the isolation and purification of total lipides from animal tissues［J］.The Journal of Biological Chem istry，1957，226(1):497－509.

［18］ LEPAGE G，ROY C C.Direct transesterification of all classes of lipids in a one-step reaction［J］.Journal of Lipid Research，1986，27(1):114－220.

［19］ 张春梅，易贤武，苑志朋，等.富含十八碳不饱和脂肪酸的植物油对体外瘤胃发酵和甲烷生成的影响［J］.畜牧与兽医，2009，41(12):16－19.

［20］ ZHANG C M，WU Y W，YUAN Z P，et al.Effects of adding m ixtures of linoleic acid and linolenic acid w ith different proportions on rumen fermentation and methanogenesis in vitro［J］.Chinese Journal of Animal Nutrition，2008，20(2):223－227.

［21］ 刘亮.体外法研究苹果酸和十八碳脂肪酸对瘤胃脂肪酸代谢及甲烷产量的影响［D］.硕士学位论文.北京:中国农业科学院，2008.

［22］ 魏宏阳，王加启.添加游离不饱和脂肪酸或植物油对瘤胃微生物生物体外发酵及微晶纤维素降解的影响［J］.畜牧兽医学报，2004，35(5):491－497.

［23］ 周倩，刘佩，李海霞，等.微生物合成共轭亚油酸机理的研究进展［J］.食品工业科技，2011(11):468－471，474.

［24］ SONG M K，WANG J H，SON Y S，et al.Addition effect of seed-associated or free linseed oil on the formation of cis-9，trans-11 conjugated linoleic acid and octadecenoic acid by rum inal bacteria in vitro［J］.Asian-Australasian Journal of Animal Science，2002，15(8):1115－1120.

［25］ KIM Y J，LIU R H，BOND D R，etal.Effectof linoleic acid concentration on conjugated linoleic acid production by Butyrivibrio fibrisolvens A 38［J］.Applied and Environmental M icrobiology，2000，66(12):5226－5230.

［26］ HUGHES P E，HUNTERW J，TOVE S B.Biohydrogenation of unsaturated fatty acids.Purification and properties of cis-9，trans-11-octadecadienoate reductase［J］.Journal of Biological Chem istry，1982，257(7):3643－3649.

［27］ 李香子.调控瘤胃发酵对甲烷及共轭脂肪酸(CLA，CLnA)生成机制影响研究［D］.博士学位论文.兰州:甘肃农业大学，2009.

［28］ 郜玉婷，叶淑红，王际辉，等.保加利亚乳杆菌利用α－亚麻酸合成共轭亚麻酸［J］.大连工业大学学报，2012，31(4):235－238.

［29］ 张春梅，苑志明，易贤武，等.亚麻酸对饲喂不同精粗比日粮的湖羊瘤胃细菌区系的影响［J］.饲料工业，2013，34(11):46－49.