胰腺癌患者外周血与肿瘤组织中KRAS基因突变的研究

权红良,于忠和

(北京军区总医院肿瘤科，北京 100700)

KRAS(K-ras)基因突变在胰腺癌发生发展、诊断、治疗及靶向药物疗效预测中均起重要的作用。目前，胰腺癌KRAS基因检测标本主要局限于组织，由于胰腺处于腹腔深处，活检难度大且易发生胰漏等严重并发症，临床难以获得组织标本。目前KRAS检测方法较多，但是由于费用高、敏感度低等缺点致使其不适合临床推广。本研究采用高敏感性的高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)法检测胰腺癌患者外周血KRAS基因突变，以探讨其临床应用价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2011年7月至2012年11月北京军区总医院、北京恒兴医院30例住院胰腺癌患者外周血标本，所有患者均经细胞学或病理学确诊。其中男17例、女13例，年龄40～89岁，中位年龄62岁；吸烟9例，不吸烟21例。同时在北京军区总医院、北京恒兴医院、空军总医院、解放军309医院收集胰腺癌石蜡标本25例，胰腺癌新鲜组织5例，其TNM分期为Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期4例，Ⅳ期4例；高分化导管腺癌13例，中低分化导管腺癌17例；胰头癌17例，胰腺体尾癌10例，全胰腺癌3例。研究对象中，组织标本与外周血标本配对13例。

1.2方法

1.2.1标本的收集 术前或放化疗前抽取患者清晨空腹外周血4 mL置于乙二胺四乙酸抗凝管中，编号后置于-80 ℃冰箱保存待测；收集胰腺癌石蜡切片置于4 ℃冰箱保存待测；收集手术切除胰腺癌新鲜组织置于浓度为5%的甲醛中保存待测。

1.2.2DNA提取 外周血DNA和石蜡切片组织DNA分别按照北京博迈德公司全血基因组DNA提取试剂盒说明书和石蜡切片组织DNA提取试剂盒说明书进行；胰腺癌新鲜组织DNA的提取是提取甲醛中保存的新鲜肿瘤组织，并用消化酶消化后参照石蜡切片组织DNA提取试剂盒说明书进行。

1.2.3DNA浓度监测 SMA4000微量紫外/可见分光光度计购自北京美林恒通科技有限公司。自提取的DNA样本中，吸取1 μL样本置于分光光度计小孔上，自动检测样本中DNA浓度。

1.2.4荧光定量聚合酶链反应 荧光定量聚合酶链反应仪器Agilent Technologies Stratagene Mx3000P购自上海吉泰生物科技有限公司，荧光定量聚合酶链反应试剂盒购自北京新基永康生物科技有限公司，KRAS引物序列:正向引物(5′-3′):GGCCTGCTGAAAATGACTGAAT，反向引物(3′-5′):ATTGTTGGATCATATTCGTCCAC；设计内参、阳性和阴性基因对照，对KRAS基因12、13密码子突变域进行体外扩增。HRM是通过实时监测升温过程中双链DNA染料与聚合酶链反应扩增产物的结合情况，如突变位点由于不匹配双链DNA在升温过程中会先解开，荧光染料从局部解链的DNA分子上释放，从荧光强度与时间曲线上就可以判断是否存在突变，从而实现定性分析。

1.3统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理，计数资料采用Fisher确切概率法，检验外周血和肿瘤组织中KRAS基因突变的一致性采用Kappa检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1胰腺癌患者外周血及组织标本中KRAS基因突变状态分析 30例外周血标本中检测出15例KRAS基因发生突变(突变率为50%)，30例组织标本中检测出21例突变(突变率为70%)。外周血和肿瘤组织配对的13例标本中，肿瘤组织存在8例突变，外周血中存在5例KRAS突变，两者突变一致性为62.5%(5/8)，一致性具有统计学意义(Kappa=0.562,P=0.024)，肿瘤组织KRAS基因突变阴性病例的外周血KRAS基因突变均阴性(表1)。

表1 胰腺癌外周血和组织标本KRAS突变一致性

2.2胰腺癌患者外周血及肿瘤组织中KRAS基因突变状态与临床特征的关系 不同临床特征突变率不同，经Fisher确切概率法分析：胰腺癌外周血中的KRAS基因突变与患者的性别、年龄、吸烟史、肿瘤部位、肿瘤分期无关(P>0.05)；肿瘤组织中的KRAS基因突变率男性高于女性(P<0.05)，与患者的年龄、吸烟史、肿瘤的部位、癌细胞分化程度、分期等均无关系(P>0.05)(表2)。

表2 胰腺癌外周血和组织KRAS基因突变与临床特征的关系

a：为突变型；b：为野生型

3 讨 论

学者们发现，KRAS基因突变是胰腺癌的早期事件[1],认为检测KRAS基因突变是对胰腺癌有效的早期基因诊断方法,美国已经把KRAS基因的检测列为消化系统肿瘤早期诊断的常规项目。Wedén等[2]发现，KRAS基因突变疫苗可巩固胰腺癌手术效果，目前针对突变KRAS基因的各种基因治疗均能有效抑制癌细胞生长[3-4]；KRAS基因突变也是用于预测表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂[5]和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)单克隆抗体靶向治疗疗效的预测因子[6-7]，运用EGFR靶向药物治疗之前必须要进行KRAS基因突变检测，因为KRAS基因突变后可以抗拒EGFR单抗而致使EGFR单抗药物治疗无效[8]。但是最新研究发现[9]，KRAS第13位密码子的突变对抗EGFR抗体类药物有治疗反应性。Bournet等[10]在实验中发现,KRAS基因的突变在鉴别胰腺良、恶性疾病中也具有一定的价值。所以KRAS基因突变对于胰腺癌的早期诊断、靶向药物疗效预测、鉴别诊断等具有重要作用。

目前，胰腺癌KRAS基因检测标本主要局限于组织，由于胰腺癌患者70%～80%在确诊时已经失去手术的机会，且胰腺处于腹腔深处，活检难度大、易发生胰漏等严重并发症而不宜活检，临床难以获得组织标本。近年来研究者主要致力于检测胰腺癌患者的胰液、粪便或外周血的KRAS基因突变代替检测胰腺癌组织。一项荟萃分析结果显示，胰液检测KRAS基因突变的灵敏度为61%,特异度为82%,虽然胰液KRAS基因的检测具有比较高的敏感性和特异性，但仍有一定的假阳性率，并且行内镜逆行胰胆管造影检查同时收集胰液检查操作复杂，术后并发胰腺炎的发生率高[11]。粪便中的KRAS基因检测无创,国外报道胰腺癌患者粪便KRAS基因检测的阳性率为42.3%～54.5%，与直接收集胰液相比,粪便中检出率较低,并且部分大肠癌和大肠腺瘤粪便中也可检出KRAS基因的突变,所以这种方法的特异性也不高。有研究发现，肿瘤在发生、发展过程中，肿瘤细胞可脱落入外周血，然后瘤细胞发生凋亡并释放出遗传物质，导致血液中存在游离肿瘤DNA，所以若原发或转移灶肿瘤细胞存在KRAS基因突变，即可从外周血游离DNA中检测出来[12]。Mulcahy等[13]对胰腺癌患者血清的KRAS基因突变进行了前瞻性研究,胰腺癌患者血浆DNA检测有KRAS基因突变,并且血浆和组织中KRAS基因突变类型相同。国外学者报道，用不同方法测得胰腺癌外周血KRAS基因的突变率可高达27%～81%[13-15]。肿瘤细胞的标志物也可能随着细胞分化增殖或有效治疗发生改变，所以动态监测外周血不失为一种代替肿瘤组织的简单、易行的方法，且能够动态监测KRAS基因状态，其采集方便，对患者创伤较小，但是胰腺癌组织与血液中KRAS基因突变的一致性问题有待进一步研究。

本研究测得胰腺癌患者外周血中KRAS基因突变率为50%，胰腺癌组织突变率为70%,其中配对样本13例，胰腺癌组织KRAS突变阳性8例，其外周血突变阳性为5例，突变一致性为62.5%(5/8)；胰腺癌组织KRAS基因突变阴性5例，其外周血突变均为阴性。本研究外周血代替胰腺癌组织标本检测KRAS基因突变未出现假阳性，但3例出现假阴性，分析原因可能为：①此3例标本分期较早，肿瘤负荷均较低，可能释放入外周血的游离DNA少；②胰腺癌组织与外周血标本获取时间点不同，所以检测结果可能不同。

现有的KRAS基因突变检测方法主要有限制性片段长度多态性分析法、直接测序法、TaqMan 探针法、HRM法、扩增阻碍突变系统(ARMS/S)法等，其中测序法是检测基因突变的标准方法，但由于其敏感性低、操作复杂而限制了其临床应用，TaqMan探针法、ARMS/S法准确度高、特异性强，但价格昂贵[16]。本研究采用的HRM法是近年国外兴起的一种全新的突变扫描和基因分型的遗传分析方法，主要原理是在聚合酶链反应结束后，根据DNA序列的长度，鸟嘌呤和胞嘧啶的含量以及碱基互补性差异，直接应用高分辨率的熔解曲线对样品进行分析，极高的温度均一性和温度分辨率使分辨精度达到对单个碱基差异的区分。正常人的血浆中存在极微量的DNA(0.01 g/L),恶性肿瘤患者血浆DNA浓度虽显著增加,但是如果基因检测方法灵敏度不高就会出现假阴性的结果。国内一个研究组率先用HRM技术从突变细胞比例低至2.5%的混合样品中检测出了变异基因[17]。Franklin等[18]在118例结肠癌标本中对比了HRM法、ARMS/S和直接测序法的检测效果，结果表明HRM法相对比较灵敏。另外有临床试验证实，此方法具有高通量、高敏感性、特异性好、重复性好、操作简便、低成本、低污染、标本范围广等优点，适于临床推广[19]。

综上所述，对胰腺癌患者外周血进行KRAS基因检测，标本容易获取，对患者创伤较小，适于临床推广，在无法获得组织学标本时可以用高敏感性的HRM法检测外周血KRAS基因突变，以提高胰腺癌的早期诊断率及指导胰腺癌的治疗，有助于改善胰腺癌患者的预后，但尚需要更大样本的深入研究。

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