玉米须黄酮分级萃取及其抗氧化活性研究

任顺成，陈雅妮

(河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

0 引言

活性自由基（如超氧阴离子自由基、羟自由基、过氧化氢等）可降解蛋白质，造成脂质过氧化以及DNA 损伤等，而这些反应与许多慢性疾病，如糖尿病、癌症、动脉粥样硬化、心血管疾病等密切相关[1].抗氧化剂可以抑制自由基的活性，阻断不良反应，避免细胞遭遇氧化损伤.因此，寻求天然的抗氧化剂已成为当今科学研究的新热点.

玉米须是我国传统的中药材，具有泄热通淋，平肝利胆的功效.研究表明，玉米须含有多种生物活性成分，具有广泛的药理功效，其中黄酮类化合物的药理功效尤为显著，具有抗菌[2]、抗肿瘤、利尿、增强免疫[3]、抑制癌细胞增值、降血糖[4]、降血脂、抗氧化[5]等作用.本研究通过比较玉米须黄酮粗提物和各萃取物对自由基DPPH·、·OH 和O2-·的清除能力，旨在寻找抗氧化能力强的黄酮极性部分，为合理利用玉米须资源和开发天然抗氧化剂提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

玉米须：购于郑州市药材批发市场；芦丁标准品：上海华硕精细化学品有限公司；1，1-二苯基-2-三 硝 基 苯 肼（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH·）：Sigma 公司；无水乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、三氯化铝、30%双氧水、三羟甲基氨基甲烷、水杨酸、硫酸亚铁、邻苯三酚等均为分析纯.

1.1.2 主要仪器

RE-52 旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；UV-7504 型紫外可见分光光度计：上海欣茂仪器有限公司；电热鼓风干燥箱：上海树立仪器仪表有限公司；AY120 型电子分析天平：日本岛津.

1.2 方法

1.2.1 样品的制备

将除杂、晾干、剪碎的玉米须分批放入40 L 的密闭容器中，用体积分数为80%的乙醇浸泡72 h，不定期搅拌，抽滤旋蒸回收乙醇，回收的乙醇调成80%后加入到提取器中，反复3 次，合并提取液，旋蒸浓缩，干燥得红褐色膏状物（即黄酮粗提取物）.

将粗提物（EF）加少量蒸馏水溶解，用石油醚萃取后将萃余液分成两部分，分别用饱和的正丁醇和乙酸乙酯反复萃取，剩余部分为水萃取物.将石油醚萃取物（PF）、正丁醇萃取物（BF）、乙酸乙酯萃取物（AF）和水萃取物（WF）分别旋转蒸发浓缩干燥至膏状，乙醇溶解备用.

1.2.2 样品中总黄酮含量的测定

参照文献[6]，以芦丁为标准品，绘制标准曲线，得回归方程：A=0.029 2X+0.009 4，R2=0.999 1.采用AlCl3比色法测定样品中黄酮含量.

1.2.3 样品液的配置

将所得样品分别稀释成黄酮含量为5、10、15、20、25 μg/mL 的样品液，进行抗氧化能力量效关系的测定.

1.2.4 抗氧化活性的测定

1.2.4.1 清除DPPH·能力的测定[7-8]

分别取不同浓度的试样液2 mL，并加入2 mL 0.2 mmol/L 的DPPH·贮备液（无水乙醇溶解），摇匀，避光静置30 min 后，用无水乙醇做参比液，测定反应体系在517 nm 处的吸光度Ai；同时测定2 mL DPPH·溶液与等体积无水乙醇混合液的吸光度Ac及2 mL 试样液与等体积无水乙醇混合液的吸光度Aj，每个样品平行测定3 次.

DPPH·清除率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%，

式中：Ai为DPPH·与试样液的吸光度；Aj为试样液与无水乙醇的吸光度；Ac为DPPH·与无水乙醇的吸光度.

1.2.4.2 清除羟自由基（·OH）能力的测定[9-11]

分别取不同浓度的试样液2 mL，加入6 mmol/L FeSO40.5 mL、1.5 mmol/L 水杨酸-乙醇溶液2 mL，再加入0.1%的H2O2溶液0.5 mL，于37 ℃启动反应，反应15 min，在510 nm 下测定各反应体系的吸光度AX；蒸馏水代替双氧水的吸光度为AX0，蒸馏水代替试样液的吸光度为A0，每个样品平行测定3 次.计算试样液的清除率.

·OH 清除率=[1-（AX-AX0）/A0]×100%，

式中：A0为空白对照液的吸光度；AX为加入黄酮溶液后的吸光度；AX0为不加H2O2溶液本底吸光度.

1.2.4.3 清除超氧阴离子自由基（O2-·）能力的测定[12]

取4.5 mL pH 8.2、0.05 mol/L Tris-HCl 缓冲液，4.2 mL 蒸馏水，混匀后在25 ℃水浴中保温20 min，取出后立即加入在25 ℃预热过的3 mmol/L的邻苯三酚0.3 mL（空白管用蒸馏水代替邻苯三酚溶液），迅速摇匀后倒入比色杯，325 nm 下每隔30 s 测定吸光度，在线性范围内计算每分钟吸光度的增加速率即邻苯三酚的自氧化速率.在加入邻苯三酚前，先加入0.5 mL 的试样液，蒸馏水减少，然后按上述方法计算抑制率.

抑制率=[（ΔA0-ΔA）/ΔA0]×100%，

式中：ΔA0为邻苯三酚的自氧化法速率；ΔA 为加入黄酮溶液后邻苯三酚自氧化法速率.

1.2.4.4 还原力的测定

取2.5 mL 0.2 mol/L 磷酸缓冲溶液（pH 6.6）及2.5 mL1%铁氰化钾，加入1 mL 不同浓度的试样液，50 ℃水浴20 min 后快速冷却，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，混匀后于3 000 r/min 离心10 min，取上清液2.5 mL，加入2.5 mL 蒸馏水及0.5 mL 0.1% FeCl3溶液，混匀后静置10 min 于700 nm 处测定吸光值.吸光值的大小表示还原力的强弱.

2 结果与分析

2.1 玉米须黄酮不同极性萃取物得率

样品按1.2.1 萃取，得率见表1.

表1 玉米须不同极性萃取物得率

由表1 可知，玉米须粗提物得率高达50%以上，经不同极性溶剂萃取后，所得萃取物含量相差较大，玉米须提取物中水溶性部分含量最高，其次为正丁醇相和乙酸乙酯相，石油醚萃取物含量最低，可见玉米须提取物中脂溶性成分含量很少.

2.2 玉米须不同极性萃取物黄酮含量

由表2 可见，玉米须不同萃取物中，乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物中黄酮含量相对较高，而石油醚萃取物中黄酮最低，由此可以推测，玉米须中的黄酮类型以中极性为主.

2.3 玉米须黄酮不同极性萃取物清除自由基（DPPH·）的能力

DPPH·是一种稳定的有机自由基，能够与一个电子或氢自由基形成一个稳定的抗磁性分子态，通过使用顺磁共振仪检测自由基信号来表示其抗氧化性的强弱，但是此方法难以普及[7，13].利用分光光度法测定清除DPPH·的能力应用较广泛，当有供氢能力的抗氧化剂存在时，DPPH·的乙醇溶液由深紫色变浅，吸光度值变小.根据吸光度的变化可测得抗氧化物的活性[14].

表2 玉米须不同极性萃取物黄酮含量

如图1 所示，玉米须黄酮粗提物和各萃取物对DPPH·都有较强的清除能力，并且随黄酮类化合物浓度的增加而增强.清除DPPH·能力大小依次为：BF＞EF＞AF＞WF＞PF.BF 对DPPH·的清除能力最强，当试样液中黄酮浓度为5 μg/mL 时，BF 的清除率为93.20%，而PF 的清除率为34.13%，与BF 的清除率存在显著性差异（P＜0.01），并且明显低于其他萃取成分.当试样液中黄酮浓度为25 μg/mL 时，BF 的清除率高达99.35%，PF 也表现出较强的清除能力，清除率高达88.17%，与其他萃取物的差异性降低.各萃取物表现出不同的清除能力，这可能是由于玉米须不同极性萃取物中所含黄酮类化合物的种类和结构不同，也可能含有其他抗氧化成分，因此对DPPH·的清除能力有所差异，进而表现出了不同的抗氧化活性.EF 的清除率低于BF，可能因为粗提物中含有较多的杂质所致.

图1 玉米须黄酮粗提物和各萃取物对DPPH·的清除作用

2.4 玉米须黄酮不同极性萃取物清除羟自由基（·OH）的能力

过氧化氢是一种非活性成分，广泛存在于生物体和食物中，当体系中存在还原性金属离子时，过氧化氢就会释放出氧化能力很强的羟自由基（·OH）[15].·OH 能够氧化有机体的多种物质，造成人体组织中脂质的过氧化、核酸的断裂、多糖和蛋白质的分解，从而导致机体受损和基因突变，引起机体衰老和癌变[16].根据Fenton 反应原理，H2O2遇Fe2+释放出·OH，水杨酸与·OH 反应生成有色物质，在λ=510 nm 处有最大吸收峰，当反应体系中存在能清除·OH 的成分时，就会与水杨酸竞争·OH，使有色产物生成量减少，吸光度也相应变小.根据吸光度的变化值测定不同浓度试样液对·OH 的清除能力.

如图2 所示，各试样液对·OH 的清除率随其黄酮浓度的增加而增强，且呈现出不同的增长趋势，清除·OH 能力大小依次为：BF＞AF＞EF＞PF＞WF，这可能是由于不同极性萃取物中所含黄酮类化合物的种类及含量不同，其清除·OH 的能力大小也不同.AF 和BF 与其他萃取物相比表现出了较强的清除力，这也可能是由于萃取部分中含有抗氧化能力较强的多酚类化合物，国内外已有众多研究表明多酚具有较强的抗氧化活性.当试样液中黄酮浓度为25 μg/mL 时，对·OH 的清除力最高为75.84%，明显弱于对DPPH·和O2-·的清除能力.

图2 玉米须黄酮粗提物和各萃取物对·OH 的清除作用

2.5 玉米须黄酮不同极性萃取物清除超氧阴离子 自由基（O2-·）的能力

超氧阴离子自由基是生命体代谢过程中产生的一种氧化能力较强的自由基，在机体中存在寿命最长.邻苯三酚在一定条件下可迅速氧化产生O2-·，O2-·作为单电子氧化剂迅速与邻苯三酚作用,使其进一步氧化,生成一系列复杂的激发态氧化产物,溶液由无色逐渐变成深黄色，在λ=325 nm 处有最大吸收峰[17].当反应中存在抗氧化剂时，就会抑制邻苯三酚的自氧化速率，使其吸光度值的变化速率减小.由吸光度的变化速率反映出玉米须黄酮粗提物和各萃取物对O2-·的清除能力.

如图3 所示，在相同的浓度下，乙酸乙酯萃取物对O2-·的清除力最强，其次是正丁醇萃取物、粗提物、水萃取物，而石油醚萃取物最弱.各萃取物对O2-·的清除力与黄酮含量且呈显著的量效关系，相关系数分别为0.937 0、0.927 9、0.975 1、0.989 0、0.993 4.当试样液中黄酮浓度为25 μg/mL时，AF、BF、EF、WF、PF 的清除率分别为94.27%、91.22%、85.03%、71.12%、68.70%，AF 的清除率高于其他萃取物，这可能是因为AF 中的黄酮类化合物对O2-·有较强的清除活性.

2.6 玉米须黄酮不同极性萃取物还原力的测定

由图4 可知，还原能力随着样液中黄酮浓度的增加呈线性上升趋势，还原力与黄酮浓度的线性相关系数分别为0.954 5（EF）、0.888 3（PF）、0.977 1（AF）、0.957 1（BF）、0.998 7（WF）.黄酮浓度为25 μg/mL 时，EF、PF、AF、BF 和WF 的吸光值分别为1.517、0.491、1.528、1.576、1.439，提取物还原力的大小排序为BF＞AF＞EF＞WF＞PF.还原力越强表明抗氧化能力越强，因此，还原力的强弱表明了各萃取物的抗氧化活性的大小，由此可知正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物具有较强的抗氧化活性.

图3 玉米须黄酮粗提物和各萃取物对O2-·的清除作用

图4 玉米须黄酮粗提物和各萃取物的还原力

3 结论

玉米须黄酮粗提物、石油醚萃取物、正丁醇萃取物、乙酸乙酯萃取物和水萃取物均有较强的还原能力并且能有效地清除DPPH·、·OH、O2-·，具有较强的抗氧化活性，且呈现出显著的量效关系.不同萃取物在各反应体系中的抗氧化活性也各不相同，其中正丁醇萃取物的还原力和对DPPH·、·OH的清除能力最强，而乙酸乙酯萃取物对O2-·的清除作用最强.当黄酮浓度为25 μg/mL 时，萃取物对DPPH·、·OH、O2-·3 种自由基均表现出较强的清除作用，清除率分别高达：99.35%、75.84%、94.27%.正丁醇萃取物和乙酸乙酯萃取物的还原力和抗氧化活性相对较强，且萃取得率高，并预示其具有强大的保健功效，因此可以做进一步的研究，分离纯化出有效的活性成分，开发出一种天然高效的抗氧化剂.

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