穴位埋线对VD大鼠学习记忆能力及血清Livin表达的影响*

刘 俊， 唐中生， 王兴桂， 谢高宇， 陈 波， 罗亚非

(1.贵阳中医学院研究生院， 贵州 贵阳 550002； 2.贵阳中医学院基础医学院， 贵州 贵阳 550002；3.贵阳中医学院针灸推拿系， 贵州 贵阳 550002)

血管性痴呆(vascular dementia，VD)是由一系列脑血管因素(缺血、出血、急慢性缺氧性脑血管病等)导致脑组织损害引起的以认知功能障碍为特征的痴呆综合征[1]，已成为威胁高龄人群生命的疾病之一。细胞凋亡是血管性认知功能损害重要的病理生理机制，认知功能损害程度与细胞凋亡有着直接的联系。目前细胞凋亡在脑血管病发病机制中受到重视，多种细胞因子作为启动因素引起缺血性脑损伤。Livin是近年发现的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein family，IAPs)家族新成员，具有较强的抗凋亡活性。本研究制备VD大鼠模型，采用穴位埋线治疗，观察VD大鼠血清Livin水平，探讨穴位埋线治疗VD的可能机制，为临床治疗VD提供一定的实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠70只，体重280～300 g，清洁级，由重庆滕鑫比尔实验动物销售有限公司提供，许可证号：SCXK(渝)2007-0006。

1.1.2 实验器材 可吸收性外科缝线(经络疏通专用线)(中国中医研究院众益科技开发公司)；电子天平(苏州精密仪器厂)；DigBehv Morris 水迷宫视频分析系统(上海吉量软件科技有限公司)；微型动脉夹(安徽淮北正华生物仪器设备有限公司)；SDQ-30双极射频电凝器(苏州手术器械厂)；一次性1mL注射针头、一次性5mL注射针头(江西洪达医疗器械集团有限公司)。

1.1.3 药品与试剂 水合氯醛、4%多聚甲醛、兔抗大鼠Livin抗体(美国R&D Systems 公司生产)检测试剂盒(贵州平生生物技术有限公司提供)、尼莫地平片(正大青春宝药业有限公司生产，批号：0801002)。

1.2 方法

1.2.1 VD大鼠模型的建立 将大鼠随机分为假手术组、VD模型组、穴位埋线组和尼莫地平组，采用改良的Pulsinelli’s四血管阻断法(four-vessel occlusion，4-VO)建立VD大鼠模型[2]。模型制作成功标准：大鼠在4条血管阻断后1-2 min内，翻正反射消失，虹膜变白及瞳孔散大。

1.2.2 治疗方法 术后第7天开始治疗，除穴位埋线组外，其余各组治疗均在每天上午9：00～11：00进行，每日1次，连续治疗15 d。

1.2.2.1 穴位埋线组 穴位选择：百会、膈俞、气海、三阴交、膻中。穴位定位：以《实验针灸学》定位位置为标准[3]。治疗方法：将可吸收性外科缝线(4～0号)剪成2 mm小段若干，放在已消毒纸上备用。使用时用镊子将其装入1 mL的注射针头，然后再将预先剪去针尖的针灸针作为针芯穿入注射针头内，组成一套埋线工具。埋线时，先以碘酒消毒，乙醇脱碘后，将注射针头刺入穴位，然后抵住针灸针针尾作注射状，迅速将针头内的羊肠线推入穴内，感觉注射针内有空虚感时方可出针，并确认羊肠线已埋入穴位内。

1.2.2.2 尼莫地平组 按20 mg/(kg·d)的用量进行灌胃治疗。

1.2.2.3 假手术组、VD模型组均给予蒸馏水1 mL/100 g灌胃。

1.2.3 Morris 水迷宫学习记忆能力检测[4]各组大鼠于术后第28 d开始水迷宫测试。Morris水迷宫为圆形水池，直径100 cm，深50 cm，水深30 cm，水温(24±2)℃，池壁上4个等距离点分水池为四个象限，选第三象限在其中央放置平台，平台无色透明，直径6 cm，高28 cm，平台没于水面下2 cm，水池周围参照物保持不变。第1～6 d进行定向航行实验，每日将大鼠按Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限的顺序从各入水点(各象限水池壁中点)靠池壁放入水中，记录60 s内大鼠从水中爬上站台所需时间为逃避潜伏期；第7 d行空间探索实验，将大鼠从第Ⅰ象限入水点放入水池，记录2 min内大鼠在第Ⅲ象限游泳时间和穿越站台次数。

1.2.4 血清采集及检测 Morris 水迷宫检测之后，于腹股沟处切开皮肤，剪断股动脉采集血液，入冰箱静置过夜后采集血清以备进行Livin含量检测。开颅取脑，取海马组织固定12 h。经梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋后，连续冠状切片(片厚5 um)。苏木素-伊红(HE)染色，光镜下观察海马神经元的病理变化。

2 结果

2.1 穴位埋线对VD大鼠Morris水迷宫的影响

2.1.1 定位航行实验 平均逃避潜伏期反映大鼠的学习能力。模型组大鼠平均逃避潜伏期与假手术组比较明显延长(P<0.05或P<0.01)，穴位埋线组与模型组相比，平均逃避潜伏期缩短(P<0.01)，与尼莫地平组无比较意义(P>0.05)。结果见表1。

表1 各组大鼠每天平均逃避潜伏期的测试

注：与假手术组比较，△P<0.01；与模型组比较，﹡P<0.05，﹡﹡P<0.01

2.1.2 空间探索实验 该实验反映了大鼠的记忆能力。VD模型组与假手术组比较，第Ⅲ象限活动时间缩短、穿越站台次数减少(P<0.01)，穴位埋线组与VD模型组比较，第Ⅲ象限活动时间延长、穿越站台次数增多(P<0.01，P<0.05)，穴位埋线组与尼莫地平组无比较意义(P>0.05)。结果见表2。

表2 各组大鼠空间探索实验第Ⅲ象限活动时间、

注：与假手术组比较，△P<0.01；与模型组比较，△△P<0.01；与假手术组比较，﹡P<0.01；与模型组比较，﹡﹡P<0.05

2.2 穴位埋线对VD大鼠血清livin含量的影响 VD模型组大鼠血清Livin含量比假手术组显著降低(P<0.01)，穴位埋线组大鼠血清Livin含量虽然也低于假手术组(P<0.05)，但与VD模型组大鼠相比明显升高(P<0.05)，结果见表2。穴位埋线可以提升VD大鼠异常降低的血清Livin含量，提示其改善VD大鼠的学习记忆能力与升高其血清Livin含量有关。

2.3 穴位埋线对VD大鼠病理形态学的影响 HE染色见假手术组大鼠海马CA1区神经元排列整齐、密集，无变性、坏死和肿胀细胞结构正常，胞浆丰富，无胶质细胞增生现象；细胞核呈圆形、椭圆形。(见Fig.1图A)；VD模型组海马组织明显水肿，血管扩张充血，并见严重的神经元肿胀、变性及坏死，神经纤维增粗紊乱。(见Fig.1图B)；穴位埋线组海马CA1区现轻微水肿、血管扩张充血，神经元出现肿胀及变性，未见神经元排列紊乱和坏死。(见Fig.1图C)；尼莫地平组海马CA1区神经元密集，出现轻微水肿和血管扩张充血，神经元现轻微肿胀和变性，未见神经元排列紊乱和坏死，神经纤维现增粗紊乱。(见Fig.1图D)。

Fig.1 各组大鼠海马CA1区神经元病理形态学观察

3 讨论

近年来的研究表明，脑缺血可引起脑神经细胞凋亡及其相关基因的表达，并认为细胞凋亡在缺血损伤中起重要作用。越来越多的证据表明：基因调控与细胞凋亡有关。影响细胞凋亡的基因按其表达物对凋亡过程的作用大致可分为两类：存活基因和致死基因。Livin是一种新近发现的抗细胞凋亡因子，以其为靶点的抑制物及反义Livin能够保护细胞不进行凋亡[5]。还有报道称Livin能够作用于细胞凋亡线粒体通路，发挥抑制细胞凋亡的作用[6]。抑制凋亡的的机制主要通过：抑制Caspasep途径、激活TAK1/JNK1信号传导途径来实现[5]。谭家泽等[7]通过对Livin检测显示VD患者Livin含量降低，提示Livin低表达参与了VD的细胞凋亡进程。张益等[8]对大鼠脑缺血再灌注脑组织Livin表达的研究显示，假手术组、正常组Livin阳性细胞数量极低，模型组Livin阳性细胞数明显增加，治疗后，Livin阳性细胞数增加，表明通过增加Livin表达，可对细胞凋亡产生抑制作用，减轻神经元的丢失。本研究发现，模型组VD大鼠Livin含量降低，与谭家泽的临床试验结果相一致。进一步观察发现，与模型组比较，埋线组可以提升VD大鼠异常降低的血清Livin含量，缓解海马神经元细胞损伤。

穴位埋线疗法属于针灸疗法的一个分支，是经络理论与现代医学手段相结合的产物，是在中医理论指导下，采用不同型号的羊肠线，根据需要有选择地埋入穴位，通过羊肠线对穴位的持续刺激作用，达到治疗疾病的一种外治方法，已经广泛应用于临床各科[9]。由于VD是一种需要长期治疗的疾病，目前针刺疗效肯定，而穴位埋线每20～30 d治疗1次，故避免需较长时间每日针刺的痛苦，使家属及患者更能坚持长期的治疗，所以穴位埋线不失为一种较为切实的治疗方法。中医认为，痴呆病人多属本虚标实，气虚血瘀。气虚则神失所养，瘀血则可随经脉流行入脑，与精髓错杂，致使清窍受蒙，灵机呆钝而出现神识不清，表情痴呆诸症。笔者选取百会、膈俞、气海、三阴交(双)、膻中组成益气活血方。百会为诸阳、百脉之会，可开窍醒神、回阳固脱。膈俞有开胸通膈治疗气滞血瘀之功。气海培补元气。三阴交可健脾益气，调补肝肾。膻中为气会，有理肺气、通乳络之功。以上五穴共同组合，共奏益气活血之功。本实验以此为基础，运用穴位埋线治疗实验性VD大鼠，观察大鼠血清Livin含量变化与埋线治疗的疗效关系，为临床运用穴位埋线治疗VD提供一定的理论依据。

Morris水迷宫已经广泛地用于动物空间学习记忆研究的实验。空间学习记忆是检测动物空间方向、反射时间、视知觉和结构应用等能力，从而评价其认知水平的一种行为模式，是一类关于场景和事件的学习记忆，因能较好地检测到实验动物的空间学习记忆功能，并有排除动物在完成作业而经过的途中所留下的排泄物和所分泌的外激素对其它动物作业成绩产生影响等优点，因而在国内外被广泛采用[10]。本实验采用经典的4-VO建立VD模型。结果发现，模型组大鼠找到站台的时间比对照组大鼠明显延长；第7天撤去站台后，VD模型组大鼠第Ⅲ象限游泳时间和穿越站台次数比对照组明显减少，结果表明，模型组大鼠学习记忆能力较对照组明显减退，应用4-VO改良法成功复制了VD模型大鼠。采用穴位埋线治疗后，大鼠找到站台的时间较VD模型组明显缩短，学习记忆成绩接近对照组，提示穴位埋线能有效改善VD大鼠的学习记忆能力。

结果显示，VD模型组血清Livin显著低于假手术组，穴位埋线组与VD模型组相比，具有显著性差异(P<0.01)，与尼莫地平组相比，无显著性差异(P>0.05)。病理结果显示，VD模型组海马CA1区神经元严重受损，导致学习记忆能力降低，穴位埋线组海马CA1区神经元恢复良好，无严重变性和坏死，说明穴位埋线可缓解脑缺血性损伤的神经细胞凋亡，从而改善学习记忆。本研究结果表明，提升血清Livin含量，缓解脑缺血后细胞凋亡，减轻海马神经元的损伤，可能是穴位埋线改善痴呆症状的机理之一。

参考文献：

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[2]刘 燕，李卫东，苗晋，等.电针对血管性痴呆大鼠脑组织MDA和AchE含量的影响[J].天津中医药，2008，25(6)：459-461.

[3]李忠仁.实验针灸学[M].北京：中国中医药出版社，2003：184-185.

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[5]Nachmias B，Ashhab Y，Buchohz V，et a1.Caspase-mediated cleavage conveFts Livin from an antiapoptotic to a proapoptotic factor：implications fordmg-resistantmelanoma[J].CancerRes，2003，63(19)：6340-6349.

[6]梁春艳，马萍.凋亡抑制蛋白Livin抗癌新靶点[J].现代肿瘤医学，2008，6(16)：1055-1057.

[7]谭家泽，蔡志友.血管性痴呆患者血清Livin、VEGF与IL-18、IFN-γ水平的临床研究[J].重庆医科大学学报，2009，9(34)：1246-1249.

[8]张益，蔡志友，晏勇.阿托伐他汀对大鼠脑缺血再灌注脑组织Livin、caspase 3表达的影响[J].重庆医学，2009，9(37)：1112-1114.

[9]蒙珊，吕计宝，文小江.穴位埋线疗法临床应用近况[J].山西中医，2012，28(2)：56-58.

[10]柯尊记，姚志彬.空间学习记忆的行为模式及其分子神经生物学基础[J].解剖科学进展，1998，4(1)：1-7.