软枣猕猴桃优良品系“2008-07”组织培养繁殖技术研究

郭志欣，顾地周，闫中雪，沈红梅，袁 浩，张学士，王秋爽

(通化师范学院 生命科学学院，吉林 通化 134002)

软枣猕猴桃(Actinidiaarguta(Sieb.et Zucc.) Planch.ex Miq.)别名中华软枣猕猴桃、软枣子、猕猴梨、猕猴桃、软枣等，是猕猴桃科猕猴桃属藤本落叶植物，其果实可食用，营养价值很高，富含维生素C、淀粉、果胶质等，可加工成果酱、果汁、果脯、罐头，也可酿酒或用于制作糕点、糖果等多种食品[1]，还可药用，有解热、健胃、止血等功能，其根及根皮对消化道癌症有一定的治疗和抑制作用。另外，软枣猕猴桃种子含油率35.62%，是一种较好的干性油。总之，软枣猕猴桃具有极高的经济和药用等价值，还是良好的蜜源和观赏植物[2]。

目前，软枣猕猴桃以野生为主，生产上多采用种子播种、扦插等方式进行常规繁殖，但种子繁殖易产生性状分离，而扦插生根率和嫁接成活率极低[3-5]，且因采集枝条或种子而对野生资源造成极大的破坏。组织培养繁殖大多以嫩芽、嫩茎、嫩叶等为材料，多采取愈伤组织诱导、愈伤组织再分化、继代增殖、生根或腋芽直接再生、继代增殖、生根等多步方式才能成苗[6-10]，尽管生根率较高，但有时愈伤组织诱导、再分化和继代增殖时，可能已经产生了变异或突变。

软枣猕猴桃优良品系“2008-07”是2008年由通化师范学院生命科学学院顾地周高级工程师经甲基磺酸乙酯处理野生软枣猕猴桃叶片后诱导愈伤组织，从愈伤组织再分化的芽苗中选出的突变体，该品系果大、质优、丰产性好。本研究以“2008-07”的嫩茎段为材料，通过筛选影响离体茎段生根和腋芽萌发生长的主要植物生长调节物质及其适宜用量，建立软枣猕猴桃的高效植株再生体系，以期为软枣猕猴桃及其优良品种的开发利用和工厂化育苗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

2007-11-15，剪取软枣猕猴桃优良品系“2008-07”的枝条(长度30 cm)，每20根1捆，用滤纸包裹后放入-4～4 ℃的冰柜中冷藏45 d，再将冷藏后的枝条进行水培促其腋芽萌发生长。待腋芽长至3～5 cm时，将嫩枝剪下，置于培养皿中用体积分数75%乙醇涮洗10 s后，移至30 g/L次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干表面水分，去除被乙醇和次氯酸钠损伤的组织和叶片后，切割成1叶1芽茎段(长度约0.5 cm)作为外植体备用。

1.2 植株再生体系的建立

为研究植物生长调节物质6-苄氨基腺嘌吟(6-BA)、吲哚乙酸(IAA)和吲哚丁酸(IBA)对软枣猕猴桃优良品系“2008-07”嫩茎段生根率及腋芽生长速度的影响，采用均匀设计法U10(103)进行试验设计。试验所用基本培养基为：(NH4)2SO426.8 mg/L，CaCl2·2H2O 30 mg/L，NaH2PO4·H2O 30 mg/L，FeSO4·7H2O 6.95 mg/L，Na2·EDTA·2H2O 9.325 mg/L，MnSO4·4H2O 1.25 mg/L，ZnSO4·7H2O 0.25 mg/L，KI 0.095 mg/L，琼脂条7.8 g/L，食用白糖10 g/L，调节pH值至6.0。培养基中植物生长调节物质质量浓度为6-BA(0.02，0.03，0.04，0.05，0.06和0.07 mg/L)、IAA(0.05，0.06，0.07，0.08，0.09和0.10 mg/L)和IBA(0.03，0.04，0.05，0.06，0.07和0.08 mg/L)。将外植体接种不同的培养基，每处理接种10个茎段，重复3次，在光照强度700 lx、光照5 h/d和温度(26±2) ℃条件下培养25 d，统计生根率，测定植株高度，结果取平均值。生根率=(生根的茎段数/接种的茎段总数)×100%；植株高度为1个培养周期后的植株总高度，植株高度(cm)=0.5+生长长度。

1.3 植株成苗培养及炼苗移栽

以再生植株茎节为材料，采取茎节增殖方式扩繁[11-12]，待小植株生长至约3 cm后，在无菌状态下打开培养瓶，将小植株靠近根部留1叶后的上部苗干剪下，并切割成1叶1段(长度约0.5 cm)的小茎段，将小茎段转接到不同培养基中，进行生根和茎段生长培养。

当软枣猕猴桃种苗扩繁到一定数量、小植株长至约2.5 cm时，将小植株从培养瓶中取出，放入20 mg/L高锰酸钾溶液中洗净根上的琼脂，再将其栽植到经10%多菌灵可湿性粉剂消毒的由草炭土、腐烂松针和河砂按体积比3∶2∶1配成的混合基质中，覆盖塑料薄膜保湿保温，控制温度为(15±2) ℃、空气相对湿度为70%，自然光照12 h/d，若温度升高至20 ℃时适当打开薄膜换气通风，早晚各喷洒1次清水。

炼苗10～12 d揭去塑料薄膜，每隔3 d于早上喷洒1次清水，15 d后每隔7 d喷施质量分数为2%的KH2PO4溶液，待苗长至25～30 cm时，连同根部土块按株距80～100 cm、行距150～200 cm定植于大田，加强肥水管理。

1.4 数据处理与分析

试验所得数据经分析处理后，确定出不同植物生长调节物质对软枣猕猴桃茎段生根和茎段腋芽萌发生长影响的显著性。在此基础上，确定对茎段生根和腋芽萌发生长影响显著的主要植物生长调节物质，再进一步补充试验确定其适宜水平。均匀设计所用软件为Uniform Design 3.0V。

2 结果与分析

2.1 6-BA、IAA和IBA对软枣猕猴桃茎段生根和腋芽萌发生长的影响

表1生根率(Y1)数据经均匀设计分析处理后，可得回归方程为：Y1=57.5+631X1-122X2-0.932X3，复相关系数R=0.986 1，剩余标准差S=2.120 0，检验值Ft=123.3>临界值F(0.05,2,7)=4.737，回归方程具有显著性。由6-BA、IAA和IBA对生根影响的显著性可知，6-BA和IAA对生根具有显著影响，而IBA对生根无显著影响。计算6-BA和IAA对生根的贡献值(U6-BA、UIAA)和贡献率(U6-BA/U、UIAA/U)可知，U6-BA=949，U6-BA/U=85.8%；UIAA=35.7，UIAA/U=3.22%，说明6-BA对生根的贡献远大于IAA。

表1植株高度(Y2)数据经分析处理后，可得回归方程为：Y2=2.07+11.9X1-11.6X2+6.97X3，复相关系数R=0.870 8，剩余标准差S=0.195 0，检验值Ft=10.98>临界值F(0.05,2,7)=4.737，回归方程具有显著性。由6-BA、IAA和IBA对生根影响的显著性可知，6-BA和IAA均对软枣猕猴桃腋芽萌发生长有显著影响，而IBA对软枣猕猴桃腋芽萌发生长影响不显著。计算6-BA和IAA对茎段腋芽萌发生长的贡献值(U6-BA、UIAA)和贡献率(U6-BA/U、UIAA/U)可知，U6-BA=0.340，U6-BA/U=40.8%；UIAA=0.323，UIAA/U=38.7%，说明6-BA对软枣猕猴桃茎段腋芽萌发生长的贡献大于IAA。

表1 基于U10(103)设计的不同植物生长调节物质对软枣猕猴桃优良品系“2008-07”嫩茎段生根与腋芽生长的影响

2.2 6-BA和IAA对软枣猕猴桃茎段生根和腋芽萌发生长的影响

由前文分析结果可知，6-BA与生根率和茎段腋芽萌发生长呈正相关，IAA与生根率和茎段腋芽萌发生长呈负相关。由此推测，培养基中IAA的质量浓度低于0.05 mg/L、6-BA的质量浓度高于0.07 mg/L时可能会使软枣猕猴桃茎段生根率更高，腋芽萌发生长情况更好。为验证此推测，设置6-BA质量浓度为0.15，0.14，0.13，0.12，0.11，0.10，0.09，0.08和0.07 mg/L，IAA质量浓度为0.05，0.04，0.03，0.02，0.01和0 mg/L，开展9个水平的补充试验(表2)，每处理接种10个茎段，重复3次，结果取平均值。

2.2.1 茎段生根 将处理后的软枣猕猴桃茎段转接到含有6-BA(0.07～0.15 mg/L)和IAA(0～0.05 mg/L)的基本培养基中(图1-A)，培养3 d后发现，在茎段基部表面出现白色凸起，6 d后凸起渐渐变形为白色锥状体，11 d后锥状体逐渐伸长形成不定根， 17 d后可见3～5条肉质的不定根形成(图1-B)。由表2可知，在6-BA质量浓度为0.10～0.12 mg/L，IAA质量浓度为0.01和0.04 mg/L时茎段生根率较高，平均生根率最高可达99.9%，均高于表1所列的10个处理。

2.2.2 腋芽萌发生长 由表2可知，茎段在含有质量浓度为0.11 mg/L 6-BA和0.04 mg/L IAA的基本培养基中培养，腋芽萌发生长较好。培养7 d软枣猕猴桃茎段开始生根，10 d后腋芽开始萌发生长(图1-C)，苗的生长较快，经过22 d的培养，苗的高度最高可达2.87 cm，高于表1中所列的10个处理的植株高度。

由以上分析可知，影响生根的主要因素及水平为0.10～0.12 mg/L 6-BA，0.01和0.04 mg/L IAA，而影响茎段腋芽萌发生长的主要因素及水平为0.11 mg/L 6-BA和0.04 mg/L IAA，IBA对茎段生根和腋芽萌发生长的影响均不显著。因此，适宜软枣猕猴桃茎段生根和腋芽萌发生长的培养基为：基本培养基+0.12 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IAA，此条件下成苗良好(图1-D)，成苗率达98.7%以上。

表2 基于U9(92)设计的6-BA和IAA对软枣猕猴桃优良品系“2008-07”嫩茎段生根与腋芽生长的影响

图1 软枣猕猴桃优良品系“2008-07”组培快繁各阶段的形态

2.3 软枣猕猴桃植株成苗培养

在培养瓶内以软枣猕猴桃再生植株茎节为材料，按照1.2节中的方法，待小植株生长至约3 cm时，留1叶将苗干剪下，切割成1叶1段的小茎段(长度约0.5 cm)，转接到不同培养基中，诱导茎段生根和生长，20～22 d可形成小植株(图1-E)。

2.4 软枣猕猴桃小植株的炼苗和移栽

小植株长至约2.5 cm时，炼苗10～12 d后，苗成活良好(图1-F)，成活率可达到98.0%以上；45 d后，苗高可达25～30 cm，将其连同根部土块定植于大田，移栽苗成活良好(图1-G)，成活率达99.5%以上。

3 结论与讨论

在软枣猕猴桃嫩茎段生根时，向基本培养基中添加0.10～0.12 mg/L 6-BA，0.01和 0.04 mg/L IAA，软枣猕猴桃嫩茎段生根速度快，平均生根率高达99.9%以上。当IAA质量浓度低于0.01 mg/L时，芽苗生根率仅为65.0%；IAA和6-BA质量浓度分别高于0.04 mg/L和0.12 mg/L时，芽苗基部膨胀并产生愈伤组织，继续培养根会从愈伤组织上产生，但有这样根的苗在炼苗移栽时，根会随愈伤组织从苗基部脱落，成活率极低，原因可能是根中和苗茎的输导组织连接疏松所致，Danielle等[13]的研究也发现了这一现象。通过6-BA、IAA和IBA对软枣猕猴桃茎段生根影响的显著性检验可知，6-BA和IAA对生根率影响显著，而IBA对生根率影响不显著，6-BA和IAA对生根的贡献率分别为85.8%和3.22%，表明6-BA对嫩茎段的生根贡献远远大于IAA，这说明软枣猕猴桃试管苗的生根对植物生长调节物质具有选择性，生根所需的植物生长调节物质主要为6-BA。据相关报道[14-15]，在培养基中辅以适量的细胞分裂素，有利于植物细胞趋于根器官功能的分化，本研究在软枣猕猴桃生根培养基中加入6-BA便对生根起主要调节作用，这与顾地周等[16]对长白瑞香组培苗生根的研究结果一致。

在软枣猕猴桃嫩茎段腋芽萌发生长时，6-BA和IAA质量浓度分别控制在0.11和0.04 mg/L，软枣猕猴桃嫩茎段腋芽萌发生长速度快，经过22 d的培养，茎段高度最高达2.87 cm。通过6-BA、IAA和IBA对软枣猕猴桃嫩茎段腋芽萌发生长影响的显著性检验可知，6-BA和IAA对嫩茎段腋芽萌发生长影响显著，而IBA对嫩茎段腋芽萌发生长影响不显著，6-BA和IAA对茎段腋芽萌发生长的贡献率分别为40.8%和38.7%，说明二者对茎段腋芽萌发生长的作用相当，

由6-BA和IAA对软枣猕猴桃嫩茎段生根和腋芽萌发生长的影响结果可知，软枣猕猴桃茎段生根和腋芽萌发生长的适宜培养基为：基本培养基+0.12 mg/L 6-BA+0.04 mg/L IAA，该培养基的成苗率达98.7%以上。同时也说明不同植物对植物生长调节物质具有不同的选择性[17]，这可能是由植物自身的基因型控制的，不同的基因型决定了细胞分裂、分化和器官重建所依赖的植物生长调节物质种类及其浓度高低的不同。

软枣猕猴桃高效植株再生体系缩短了茎节的增殖周期，提高了增殖倍数，王雯雯等[18]开展的大字杜鹃快繁研究也报道了该方法。该方法成本低，简捷而可操作性强，可用于工厂化育苗。

目前，国内外已有许多猕猴桃优良品种的人工繁殖获得成功[19-20]。我国野生猕猴桃品种资源丰富，但这些品种人工繁殖并开发利用的极少。软枣猕猴桃是我国珍贵的经济植物资源，特别是优良性状株系至今未见推广应用。本研究建立了软枣猕猴桃的高效植株再生体系，为软枣猕猴桃及其优良品种的开发利用和工厂化育苗奠定了基础。

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