热休克蛋白27心肌特异性高表达诱导小鼠产生心肌肥厚

老年人心脏病患者常伴有心肌肥厚的病理改变,临床和基础研究已证实心肌肥厚是老年人心脏衰竭和致死性心律失常发生的独立危险因子。随着年龄增加,心肌肥厚进展而引起心肌舒缩障碍,最终导致心衰[1]。因此研究心肌肥厚发生发展的分子机制,通过干预其关键分子靶点而抑制心衰发生,已成为心血管领域众多学者们关注的焦点。

热休克蛋白27(Hsp27)又名HspB1,是小热休克蛋白家族的重要成员,其在心肌和骨骼肌等组织细胞中的表达尤为丰富[2]。本课题组在前期构建好的中度表达Hsp27的转基因(TG)小鼠模型发现,心肌特异性表达Hsp27抑制异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚,深入研究发现该TG小鼠心肌特异性表达Hsp27还具有降低阿霉素诱导的心肌凋亡[3-4]。然而,Xu等[5]研究发现,过表达的β-肾上腺受体TG小鼠引起的心肌病和心衰模型中,心肌组织内Hsp27蛋白的表达水平明显升高并出现了氧化应激现象。本文旨在探讨Hsp27高表达的TG小鼠中,心肌及心功能变化情况，以及Hsp27高表达对TG小鼠存活率的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本课题组与南京大学模式动物中心合作,通过心肌特异性表达启动子α-MHC启动,人为构建不同Hsp27表达量的TG小鼠,并饲养于该动物中心SPF级动物房。本研究中以10只8周龄的Hsp27高表达TG雌鼠为实验组,平均体质量为(23.12±3.19) g,10只周龄和性别匹配的野生型(WT)小鼠为对照组,平均体质量为(22.15±2.24) g。所有实验遵循南京大学动物伦理委员会要求和实验动物管理规定。

1.2 方法

1.2.1 心功能测定:鼠腹腔注射三溴乙醇(200 mg/kg)麻醉后剃毛,暴露胸部,由心超室医师进行超声检查(vivo770心脏系统,Visualsonics,探头频率13MHz)，保存M超声图片。再通过测量至少5个连续心动周期的参数平均值得到心功能参数。

1.2.2 蛋白印记:取出冷冻保存心脏组织,冰上加入600 μl裂解液,电动匀浆器以13 000 r/min匀浆。4 ℃,10 000 r/min,离心20min后提取总蛋白。将总蛋白置于120 ml/L SDS-PAGE凝胶进行电泳,电泳结束后将蛋白转移到PVDF膜(milipore 公司)上(100 V,60 min);5%脱脂牛奶封闭1 h后,分别以Hsp27(1∶25 000)(Cell Signaling Technology 公司)、GADPH(1∶5000)(Cell Signaling Technology 公司)4 ℃摇床过夜;次日用TBST洗膜后,将PVDF膜与辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)(Vector 公司)(1∶20 000)置于4 ℃摇床下孵育2 h;免疫印迹以ECL(Pierce公司)显影、曝光。

1.2.3 实时定量PCR:从小鼠心室提取总RNA,然后mRNA逆转录成cDNA。配总体积20.5 μl反应体系:Mix Syber-green 12.5 μl,引物4 μl,ddH2O 3 μl,cDNA 1 μl。放入Roche PCR分析仪器里,反应条件为:95 ℃预变性10 min,然后95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,共40循环,72 ℃ 5 min。反应结束后,置于4 ℃冰箱,备电泳。ANP和BNP可作为判断心功能不全的指标,是心肌肥厚标记物[6]。实验中所用的引物如下:

ANP:上游引物:5-TGAGCCGAGACAGCAAACATC-3;下游引物:5-AGGCCAGGAAAGGAAGAAGC-3。

BNP:上游引物:5-GGGCTGTGACGGGCTGAGGTT-3;下游引物:5-AGTTTGTGCTGGAAGATAAGA-3。GAPDH:上游引物:5-ACGCAACAGGGTGGTGGAC-3;下游引物:5-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3。

2 结果

2.1 TG鼠中的Hsp27心肌表达鉴定 为检验不同TG系小鼠心肌组织内Hsp27蛋白的表达水平,本课题组提取了小鼠的心脏组织蛋白,通过Western blot技术检测不同品系的Hsp27蛋白表达。如图1所示,不同TG系的心肌Hsp27蛋白表达水平高低不等: TG85与TG94相比,Hsp27蛋白表达水平明显升高(P<0.01),TG10和TG21与TG85的Hsp27蛋白表达水平相比又进一步升高(P<0.01)。Hsp27表达量最高的品系为TG10 和TG21,表达量中等的品系为TG85,而表达量较低的品系为TG94。

注:TG85与TG94比较,**P<0.01;TG21和TG10与TG85比较,△△P<0.01图1 不同品系TG小鼠Hsp27表达水平的比较

2.2 高表达Hsp27的TG10鼠产生心肌肥厚 本课题组从小鼠心脏大体形态、质量及心肌肥厚标记物水平3个方面观察不同表达量的Hsp27对小鼠心脏的作用,结果显示Hsp27高表达会诱导小鼠产生心肌肥厚。如图2所示,与WT相比,Hsp27高表达的TG10组心脏体积明显增大(图2A)。TG10的心脏质量(mg)/体质量(mg)HW/BW、心脏质量(mg)/胫骨长(mm)HW/TL比值明显高于WT(P<0.01; 图2B)。TG10鼠与WT鼠相比,心肌肥厚标志物ANP、BNP的mRNA水平也明显升高(P<0.01; 图2C)。

2.3 高表达Hsp27的TG10鼠表现心功能不全 如表1中所示, TG10小鼠的左心室容积和左心室质量对于WT小鼠都有显著增加(P<0.01或P<0.05)。代表心脏收缩功能射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)和心脏舒张功能的早/晚舒张比率(E/A)在TG小鼠中都有着明显下降(P<0.01或P<0.05),提示TG10小鼠出现心功能不全。

图2 WT和高表达Hsp27的TG10小鼠心功能情况

项目WTTG10EF(%)(n=10)64.23±4.6748.40±8.01∗∗FS(%)(n=10)34.15±3.2024.12±4.69∗∗LVIDd(mm,n=10)3.29±0.473.77±0.38∗LVIDs(mm,n=10)2.17±0.362.87±0.43∗∗LVVd(ml,n=10)45.10±15.3161.87±14.60∗∗LVVs(ml,n=10)16.37±6.5532.61±11.25∗∗左室质量(mg,n=10)75.39±13.7792.87±15.12∗左室质量Corrected(mg,n=10)60.32±11.0174.30±12.10∗二尖瓣E/A(n=6)1.68±0.191.32±0.24∗

注:LVIDd:舒张期左室内径; LVIDs:收缩期左室内径; LVVd:舒张期末期左室容积; LVVs:收缩期末期左室容积;与WT组比较,*P<0.05,**P<0.01

2.4 高表达Hsp27的TG10鼠死亡率升高 如图3所示,43周龄的TG10鼠便出现了死亡。85周龄WT存活率为100%,而TG10存活率仅为63.64%。TG10与WT相比,88周龄存活率明显降低(P<0.01)。

注：与WT组比较，**P<0.01图3 WT高表达Hsp27的TG10小鼠生存曲线图

3 讨论

本研究结果发现,Hsp27在TG10小鼠心肌肥厚的发生、发展中起着重要的作用,TG10小鼠心肌特异性高表达Hsp27诱导产生心肌肥厚和心功能不全,最终导致TG10小鼠寿命缩短。提示Hsp27可以作为心肌病患者,如结蛋白心肌病,潜在治疗靶点。

Hsp是一种应激蛋白[7],Hsp家族按分子量分为以下几个亚族:Hsp10,小分子Hsp(sHsp),Hsp40,Hsp60,Hsp70,Hsp90和Hsp110[8]。Hsp27是小分子sHsp家族中重要的成员之一,具有抵抗热休克、氧化应激、炎症、凋亡等作用,是应激情况下维持内环境稳态的重要作用因子[9-11]。本课题组前期研究已经表明,心肌特异性适度表达Hsp27通过抗氧化作用,改善阿霉素诱导的心功能不全和内毒素导致的心肌损伤[5,12]。Peart等[13]发现,Hsp27还参与了衰老过程中阿片类物质介导心肌保护。然后Arrigo等[9]发现,在小鼠成纤维细胞中Hsp27的高表达显著降低胞内活性氧(ROS)的基础水平并上调总谷胱甘肽水平。Rajasekaran等[14]发现,R120G aB-crystal TG小鼠中还原应激导致蛋白质的聚集增多,从而诱导产生结蛋白心肌病。有趣的是,在存在还原应激的心肌病模型中发现心肌中Hsp27的水平显著增加[14]。在本研究中,发现相似的现象。因此,本课题组推测心肌中高表达Hsp27的TG10小鼠可能是通过还原应激从而引起心肌肥厚。

心肌肥厚的本质是蛋白质的合成和降解平衡紊乱:在各种不同的外界刺激作用下心肌蛋白质的合成异常增多,而清除蛋白质聚集的代谢途径受到抑制,导致心肌细胞体积增大和肌纤维增粗、增多,从而使心肌舒缩障碍,最终导致心力衰竭[15]。大量研究发现,心肌肥厚的发生发展与Hsp27、还原应激有关,但此病理过程中确切分子机制还未被清晰阐明。

本课题组下一步将通过对心肌组织进行氧化产物检测,以明确Hsp27高表达是否会引起还原应激,进而确定其具体分子机制,这对心肌肥厚、心肌老化的预防及治疗,缓解心脏由代偿阶段向失代偿阶段转变有重大意义,为不可逆性心力衰竭的发展提供一个新的治疗靶点。

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