1α,25-二羟维生素D3对成骨细胞增殖分化、I型胶原及核心结合因子α-1基因表达的影响

成骨细胞(OB)骨形成与破骨细胞(OC)骨吸收之间的平衡是维持骨组织不断更新、保持骨质量的基本过程,一旦OB生成不足将直接导致骨形成减少,不能及时补充骨吸收和骨量丢失,进而引起骨质疏松症等各种代谢性骨病[1]。1α,25-(OH)2D3对骨代谢影响具有两重性, 既能促进骨形成,又能刺激骨吸收,其机制可能依赖于OB核内的特异性受体以及通过跨膜信号转导引起一些快速的生物学效应[2-3]。同时,骨组织表面覆盖一层由OB和未矿化的Ⅰ型胶原(Col Ⅰ)等骨基质构成的屏障,阻止破骨细胞活化和与矿化骨基质接触,抑制骨吸收[4]。Col Ⅰ合成在细胞增殖期占主导地位,可增加细胞的多层形成,与细胞进一步分化关系密切,已有研究证明ColⅠmRNA在OB增殖期就开始表达,增殖晚期mRNA的表达明显升高,且1α,25-(OH)2D3刺激可促进ColⅠmRNA表达, 进而促进OB的分化和成熟[4-5]。核心结合因子α-1(Cbfa-1)是OB分化、功能及骨形成重要的转录因子。Cbfa-1不仅能在非OB或成骨前体细胞上调节骨分化相关基因的表达,使其向OB分化,还能调节已分化OB的功能和其他生长因子的基因表达[6]。Cbfa-1 mRNA是被激活的OB标志性的表达基因,相关研究应用基因敲除小鼠模型, 发现敲除Cbfa-1基因可导致OB分化完全受阻, 使骨骼的膜内成骨和软骨内成骨均受抑制[7-8]。因此,ColⅠ和Cbfa-1基因的表达与人各种骨代谢性疾病都有着密切的关系。本研究将通过体外培养新生SD乳鼠颅盖骨的OB,在细胞和基因水平上探讨 1α,25-(OH)2D3对OB增值、ColⅠ及Cbfa-1基因表达的影响,从而为临床治疗各种代谢性骨病提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂 胎牛血清(杭州四季青公司产品); Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶、HEPES、噻唑蓝(MTT)、 二甲基亚砜 (DMSO) 、1α, 25-(OH)2D3(美国Sigma); 青霉素、链霉素(Hyclone 公司); 碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(南京建成生物工程研究所提供);RT反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、dNTP和Trizol总RNA提取试剂盒(MBI 公司产品); 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒与 RNA 提取试剂盒(Takara 公司)。

1.2 仪器 CO2细胞培养箱(Precision Scientific公司); 分光光度计(U2200,HITACH,日本);电泳仪(Bio-Rad Power-PAC200,美国);PCR热循环仪 (Hybaid, 美国);7500型实时荧光定量 PCR仪 (通用生物系统公司美国); 凝胶成像分析仪(UVP-97-0129-02, 美国)。

1.3 新生大鼠颅骨OB的培养及鉴定 无菌条件下,取出生24 h内新生SD乳鼠 (雌雄不限,清洁级,由湖北医药学院SPF级动物实验中心提供) 的颅骨, 用含平衡盐溶液 PBS冲洗数次, 放入0.25%的胰蛋白酶溶液中,剔除骨表面被膜及软组织,将骨片剪成 1～3 mm3的骨粒, 弃去胰蛋白酶溶液。在0.1% 胶原酶Ⅱ、37 ℃环境下振荡消化50 min, 收集消化液, 在4 ℃、1000 r/min 条件下离心10 min 使细胞沉淀,平衡盐溶液 PBS洗3遍。将骨粒分散于100 ml培养瓶中, 加入含20%胎牛血清的DMEM培养液, CO2培养箱中(37 ℃、5% CO2、100%空气、95%湿度)静置培养5 d后, 将骨粒弃去,细胞进行传代培养,细胞用胰蛋白酶消化,用含10%胎牛血清的DMEM培养基吹打传代。细胞传至第3～4代后,通过细胞形态学观察及ALP细胞化学染色鉴定所用细胞为OB。细胞计数后,用含 10%小牛血清的DMEM 培养基稀释成 4×104/ml的细胞悬液,接种于96孔培养板(150 μl/孔),接种于24孔培养板(500 μl/孔),CO2培养箱中培养, 镜下观察待细胞80%融合时,将含血清培养基吸弃,平衡盐溶液冲洗2次, 加入含不同浓度1α, 25-(OH)2D3的无血清培养基,继续培养,不同时间检测细胞的增殖、分化、Col Ⅰ和Cbfα-1 mRNA表达。

1.4 药物干预 1α,25-(OH)2D3溶于无水乙醇配成100 μmol/L贮存液,实验时用无血清培养基分别稀释为1、10、100 nmol/L,设置为1α, 25-(OH)2D3干预组,另设空白对照组(培养液中含无水乙醇10 μl),每个实验组设6个复孔。

1.5 细胞增殖功能测定 接种于96孔培养板各实验组分别干预处理细胞24、48 h和72 h吸去培养基,换上无血清培养基,每孔加入 MTT 20 μl,使其终浓度为500 mg/L,于CO2培养箱中继续孵育4 h, 离心吸弃上清,每孔加入 150 μl二甲基亚砜振荡溶解沉淀, 10 min后用酶联免疫检测仪测定各孔492 nm 吸光度值(A)。

1.6 ALP 接种于24孔培养板各实验组分别干预处理细胞24、48和72 h后,PBS冲洗2次,给每孔加入250 μl 0.1% TritonX-100、4 ℃反复冻融破碎细胞, 离心后收集上清液,按ALP试剂盒说明,采用对硝基苯磷酸二钠基质动力学法(PNPP法)测定ALP活性,Bradford法测定细胞液蛋白浓度,ALP活性用蛋白浓度校正,结果以每克蛋白中ALP国际单位(U/g 蛋白)表示。以ALP活性表示细胞分化程度。

1.7 RT-PCR检测成骨细胞Col Ⅰ 和Cbfa-1 mRNA表达:(1)细胞内总RNA的提取:用4 ℃PBS缓冲液洗涤细胞3次,按照说明书提取细胞系总RNA,并测定浓度。具体方法:向每个培养瓶细胞中加入1 ml Trizol reagent,收集细胞,转入1.5 ml塑料离心管中,室温静置5 min加入200 μl氯仿,剧烈震荡15 s,静置2 min后4 ℃离心15 min;吸取上清,加入500 μl异丙醇,上下颠倒几次离心管,室温静置10 min后4 ℃离心10 min;弃去上清,加入1 ml 70%乙醇洗涤沉淀,4 ℃离心10 min;弃上清,干燥沉淀,加入10 μl无RNA酶的去离子水溶解沉淀,提取的总RNA -70 ℃保存。(2)总RNA的鉴定和定量:取5 μl RNA溶液,应用RNA的甲醛变性琼脂糖凝胶电泳测定RNA的纯度和完整性。另取5 μl RNA溶液,稀释后紫外可见分光光度计测其260 nm和280 nm波长的吸光度,A260 nm/A280 nm比值在1.8～2.0,所提RNA可用于RT-PCR实验。 RT-PCR引物序列及反应条件为:(1)根据Genebank并参照文献设计Col Ⅰ、Cbfa-1和β-actin 3对基因的引物,由上海生工生物工程公司合成。(2)反转录: 总反应体系为50 μl,内含10× PCR buffer 5 μl,反转录产物1 μl,Taq酶0.25 μl,上下游引物各1 μl,补充灭菌去离子水至20 μl。(3)Col Ⅰ扩增条件: 94℃预变性5 min,94 ℃变性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共30个循环,最后延伸5 min后终止反应,4 ℃冷却。(4)β-actin:95 ℃10 s变性, 50个循环, 95 ℃ 5 s, 62 ℃ 30 s。(5)Cbfa-1扩增条件: 95 ℃预变性5 min,94 ℃变性30 s, 55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,30个循环后72 ℃延伸反应增加7 min后终止反应,4 ℃冷却。(6)扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳,DNA条带的单位面积光密度用凝胶成像仪测定,产物鉴定以 PCR maker 为标准,通过凝胶成像分析仪对目的基因和参照基因条带进行像素值测定,并计算出二者比值,半定量其mRNA表达水平,各组均重复3次后进行统计学分析。

2 结果

2.1 1α, 25-(OH)2D3对细胞增殖活性的影响 在72 h内,1、10 nmol/L组细胞增殖与时间呈正相关(r=0.998和0.999,P<0.05)。与0 nmol/L组比较,1 nmol/L组细胞A值在24、48 h和72 h,分别增加20.50%、38.77%和18.22%,差异均具有统计学意义 (P<0.05);但10 nmol/L组与0 nmol/L组比较,A值差异无显著性(P>0.05);同时100 nmol/L组细胞A值在干预72 h后减少19.30%,具有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 1α, 25-(OH)2D3对体外成骨细胞增殖的影响

注:在同一时间点,各组与0 nmol/L组比较,*P<0.05;同一浓度组内,干预72 h、48 h与24 h比较,△P<0.05

2.2 1α, 25-(OH)2D3对细胞ALP活性的影响 与0 nmol/L组比较,10、100 nmol/L组细胞ALP活性在干预24、48 h和72 h,均显著增加(P<0.05);但1 nmol/L组细胞ALP活性与0 nmol/L组比较,差异均无统计学意义 (P>0.05);Pearson相关性分析显示,干预72h后,1α, 25-(OH)2D3对细胞ALP活性的影响有剂量依赖性(r=0.969,P<0.05)。见表2。

表2 1α, 25-(OH)2D3对体外成骨细胞ALP活性的影响蛋白，n=6)

注:同一时间点,各组与0 nmol/L组比较,*P<0.05;同一浓度组内,72 h、48 h与24 h比较,△P<0.05

2.3 1α, 25-(OH)2D3对细胞Col Ⅰ基因mRNA表达的影响 0、1、10、100 nmol/L组细胞Col Ⅰ基因mRNA表达与时间呈正相关。与0 nmol/L组比较,100 nmol/L组细胞Col Ⅰ基因mRNA表达在24、48 h和72 h,分别增加85.87%、95.69%和85.93%,且差异均有统计学意义(P<0.05);10 nmol/L组Col Ⅰ基因mRNA表达分别增加38.04%、31.55%和24.37%,差异具有统计学意义 (P<0.05);但1 nmol/L组与0 nmol/L组比较,差异无统计学意义 (P>0.05);Pearson相关性分析显示,干预72 h后,细胞Col Ⅰ基因mRNA表达呈剂量依赖性增加(r=0.985,P<0.05)。见表3。

表3 1α, 25-(OH)2D3对体外成骨细胞Col Ⅰ基因mRNA表达的影响

注:同一时间点,各组与0 nmol/L组比较,*P<0.05;同一浓度组内,72、48 h与24 h比较,△P<0.05

2.4 1α, 25-(OH)2D3对细胞Cbfa-1基因mRNA表达的影响 0 nmol/L组细胞Cbfa-1基因mRNA表达与时间呈正相关(表4)。与0 nmol/L组比较,100 nmol/L组Cbfa-1基因mRNA表达在24、48 h和72 h,分别增加116.67%、96.19%和98.29%,且差异均有统计学意义(P<0.05);10 nmol/L组Cbfa-1基因mRNA表达分别增加61.91%、43.71%和35.04%,差异具有统计学意义 (P<0.05);而1 nmol/L组与0 nmol/L组比较,差异无统计学意义 (P>0.05);Pearson相关性分析显示,干预72 h后,1α, 25-(OH)2D3可诱导细胞Cbfa-1基因mRNA的表达,且呈剂量依赖性增加(r=0.969,P<0.05)。

表4 1α, 25-(OH)2D3对体外成骨细胞Cbfa-1基因mRNA表达的影响

注:同一时间点,各组与0 nmol/L组比较,*P<0.05;同一浓度组内,72、48 h与24 h比较,△P<0.05

3 讨论

固醇类激素1α,25-(OH)2D3是人体必需维生素,可调节OB的增殖、分化,在维持体内钙磷代谢平衡及骨骼结构等方面有重要作用[9]。骨质疏松症的发病机制主要与骨形成和骨吸收的动态平衡被破坏,骨形成落后于骨吸收有关。OB和破骨细胞是参与骨代谢的重要细胞,共同维持骨代谢平衡[10]。OB来源于骨髓间质细胞,是骨代谢的主要功能细胞,是骨发生和骨重建的物质基础,负责骨基质的合成、分泌和矿化。刺激OB增殖并促进其分化成熟是防治骨质疏松症的主要方法[11],体外培养的OB也是进行抗骨质疏松新药筛选和药效学评价的重要模型[12]。相关研究已证实1α, 25-(OH)2D3可干扰OB的增殖和分化能力[13-14]。本研究结果显示,1 nmol/L 1α, 25-(OH)2D3能显著增加MTT的A值,刺激OB增殖,与0 nmol/L组比较,差异有统计学意义,但达到100 nmol/L时,出现OB增殖被抑制。骨形成取决于OB的数量与活性,研究结果提示低浓度1α, 25-(OH)2D3能增强OB的增殖能力,可抑制骨吸收及促进骨形成,可拮抗骨质疏松。

OB在骨形成过程中经历细胞增殖、细胞外基质成熟、细胞外基质矿化、细胞凋亡4个阶段[15]。ALP是OB分泌的特异性很高的酶蛋白,是OB分化成熟的重要标志。分化程度越高, 分泌矿化基质的能力越强,则ALP活性越高,反之则降低[16]。本研究结果显示:与0 nmol/L组比较,100 nmol/L 1α, 25-(OH)2D3可显著提高ALP活性,而1 nmol/L组ALP活性被抑制。ALP可催化分解有机磷酸释放无机磷, 增加局部无机磷酸的浓度, 促进矿化, 所以ALP活性升高可为细胞间质含量改变做好准备, 并且是启动矿化的必备条件[17]。ALP 活性越高, 说明前OB向成熟的OB分化地越明显。本研究结果提示高浓度1α,25-(OH)2D3可增强OB分泌ALP而诱导细胞分化,但是1 nmol/L 1α,25-(OH)2D3有拮抗分泌矿化基质的能力。有研究发现OB增殖与分化呈负相关,OB分裂、增殖速度减慢常是细胞分化的结果[18],与本研究报道的结果一致。

Col Ⅰ是骨组织中OB合成分泌的的骨结构蛋白,与骨发生、骨生长及骨重建等过程密切相关,为骨矿化提供结构基础,可作为OB成熟后功能活动的标志性产物[19]。Col Ⅰ mRNA在OB增殖期就表达,增殖晚期mRNA表达明显升高从而进入基质成熟期[20]。本研究结果显示1α,25-(OH)2D3干预组Col Ⅰ基因mRNA表达均增加并呈剂量-效应关系,本结果与相关报道基本一致[21]。Col Ⅰ含量的高低与OB骨形成能力的强弱表达一致,Col Ⅰ表达量高提示OB的骨形成能力较强,反之较弱,而过度表达又诱导OC骨吸收增强,使旧骨质中的骨盐溶解而增加骨钙释放。研究结果提示高浓度1α,25-(OH)2D3可诱导Col Ⅰ基因过度表达,使细胞外基质形成、骨成熟和骨矿化的能力高于低浓度,反而不利于OB骨形成。

Cbfa-1作为第一个被识别的成骨分化关键性的特异性转录激活因子,表达于OB系早期,可与OC启动子特异性DNA序列结合[22]。现已证明Cbfa-1是OB特异性表达的2个关键调控者,是OB分化和功能的中心调控因子,决定着OB的发生与分化,调节骨质矿化,在OB发育、分化和骨形成过程中起着至关重要的作用,可作为OB成熟后功能活动的标志性产物[23-24]。本研究结果显示1α, 25-(OH)2D3干预组可诱导细胞Cbfa-1基因mRNA表达均呈剂量依赖性增加,100 nmol/L组与0 nmol/L组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。有研究证实Cbfa-1基因敲除纯合子小鼠完全缺乏骨组织,诱导OB分化完全受抑制,使骨骼的软骨内骨化成骨和膜内骨化成骨均不能发生,骨内无矿化中心出现;在非OB如皮肤成纤维细胞过表达Cbfa-1,可诱导出OB特异性标志物如Col α Ⅰ、BSP和OC的表达;若诱导成熟OB中Cbfa-1高表达,可刺激OC骨吸收,可抑制OB成骨过程[25-26]。研究结果提示高浓度1α, 25-(OH)2D3可诱导Cbfa-1高表达甚至过度表达,而低浓度1α, 25-(OH)2D3可促进OB中Cbfa-1表达升高,调节骨基质沉积速率,增强OB成骨功能。

综上所述,在本实验浓度范围内1α, 25-(OH)2D3可诱导OB增殖和分化,对骨代谢产生影响,对OB成骨相关基因如Col Ⅰ和Cbfa-1mRNA表达的影响与细胞增殖和分化状态有关,并呈时间和剂量依赖性,此研究结果对明确骨质疏松的发生机制及临床治疗具有一定价值。

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