布鲁氏菌种/型鉴别的研究现状

闫飞，郑文艳，张专才，曲芬

·专题综述·

布鲁氏菌种/型鉴别的研究现状

闫飞，郑文艳，张专才，曲芬

布鲁菌病是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患病，世界动物卫生组织将其列为重要传染病，近些年发病率呈上升趋势。应用分子生物学技术进行布鲁氏菌种/型分类的研究具有重要意义。本文通过总结近年来布鲁氏菌种/型鉴定的研究进展，为今后判断预测疫情动态、研究流行特点以及制定合理有效的防治对策提供重要的理论依据。

布鲁杆菌病；布鲁杆菌属；分子生物学；总结性报告专题

布鲁菌病（布病），又称波浪热、地中海弛张热、马耳他热或波状热，是由布鲁氏菌引起的一种人畜共患病[1]。世界动物卫生组织将其列为重要传染病，我国将其列为乙类传染病，也被列为《家畜家禽防疫条例实施细则》中第二类传染病，属自然疫源性疾病[2]。染病家畜是人感染的主要传染源。该病呈点状分散分布。该病起源于公元前1600年的埃及第5次瘟疫时期[3]。在20世纪50年代，美军成功研发的第一个细菌武器菌种即为布鲁氏菌[4]。在全世界200多个国家和地区有170多个国家和地区有人畜布病存在和流行，全球1/6～1/5的人受该病威胁[5-7]。人和牲畜发病率较高的国家和地区为希腊、西班牙、马耳他、意大利和苏格兰等。在亚洲，蒙古人民共和国人畜布病比较严重[8-11]。在我国，布病主要流行在内蒙古自治区、新疆维吾尔自治区、西藏自治区、黑龙江等9个省（自治区），其人间和畜间报告病例数占全国报告病例数的98%以上[12]。布病主要感染人群是从事宰杀、饲养牲畜、皮毛加工、收购皮毛或牲畜的人员以及兽医。布鲁氏菌在皮毛中可生存1.5～4个月，特别是羊布鲁氏菌对人类健康的威胁最大[13-14]。近些年我国布病流行呈上升趋势。

1 布鲁氏菌的生物种/型分类

1970年联合国粮食及农业组织及WHO布病专家委员会把布鲁氏菌分为6个生物种，即羊布鲁氏菌（Br.melitensis）、牛布鲁氏菌（Br.abortus）、猪布鲁氏菌（Br.suis）、沙林鼠（木鼠）布鲁氏菌（Br.neotomae）、绵羊附睾布鲁氏菌（Br.ovis）及犬布鲁氏菌（Br.canis）[14]。国内布鲁氏菌的研究者根据布鲁氏菌生化反应特点及菌体表面的不同结构，将其分为9个不同的种，其中7种感染陆生哺乳动物，为羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、绵羊附睾布鲁氏菌、沙林鼠（木鼠）布鲁氏菌、犬布鲁氏菌和田鼠布鲁氏菌（Br. microti）；2种感染海洋哺乳动物，为海豚布鲁氏菌（Br. ceti）和鲸布鲁氏菌（Br.pinnipedialis）[15]。几种主要布鲁氏菌的发现及流行概况[16-18]详见表1。

上述6个生物种又分为19个生物亚型。除沙林鼠（木鼠）布鲁氏菌、犬布鲁氏菌、绵羊附睾布鲁氏菌各占1种亚型外，其余根据牛布鲁氏菌T6噬菌体裂解试验和氧化代谢试验把羊、牛、猪3个生物种区分为若干个生物型，包括牛布鲁氏菌的8个生物型，即牛1、2、3、4、5、6、7、9型；羊布鲁氏菌的3个生物型，即羊1、2、3型；猪布鲁氏菌的5个生物型，即猪1、2、3、4、5型[19]。

2 布鲁氏菌种/型的生物学特性

布鲁氏菌种的基因组大小和组成十分相似，基因组的平均长度约为3.39Mb，并由2个环形的染色体组成，染色体Ⅰ长度约为2.11Mb，G┼C含量为57.2%；染色体Ⅱ长度约为1.18Mb，G┼C含量为57.3%。所有菌种及它们的生物型变种染色体DNA的同源性在90%以上。在布鲁氏菌染色体上，有一个长度为14 Kb的DNA片段，该片段含有7个高度保守的基因参与了O链的生物学合成，而且这7个基因在R型布鲁氏菌中也呈现高度保守状态，它们分别是WbKA、gmd、per、wzm、wzt、wbkB和wbkC，分别编码相应的酶和蛋白甘露糖转移酶、GDP2甘露糖4,6脱水酶、perosamine合成酶、ABC运载体Ⅰ（所有膜蛋白）、ABC运载体Ⅱ（ATP酶）、一个假设的功能未知的蛋白和一个假定的甲酰基转移酶，其中wzm和wzt与菌体表面O链的缺失有关[20-21]。目前发现的O链表面有7个不同的抗原位点，它们分别是A、M、C（M=A）、C（M＞A）、C/Y（M＞A）、C/Y（M=A）、C/Y（A＞M）等，菌体A、M、C、C/Y抗原的比例与种/型有关。O链表面的7种抗原决定基在所有的S型布鲁氏菌中分布具有不均一性。在同一种内，不同菌株之间A抗原和M抗原的分布及分布的数量都不相同。M抗原和A抗原除了2种R型布鲁氏菌（绵羊附睾布鲁氏菌和犬布鲁氏菌）外，在其他4种布鲁氏菌（羊布鲁氏菌、牛布鲁氏菌、猪布鲁氏菌、沙林鼠布鲁氏菌）及它们的生物型变种中均有不同程度的分布[3]。

最早发表的羊布鲁氏菌M16基因组显示，其基因组包括2条分别为2.1 Kb（Ⅰ）和1.2 Kb（Ⅱ）的染色体。Ⅰ号染色体编码2059个开放阅读框（1653+，1006-），其中已知的编码蛋白134个（77+，57-），占6.5%；Ⅱ号染色体编码1138个开放阅读框（549+，590-），其中已知的编码蛋白53个（25+，28+），占4.7%。同2002年随后发表的猪布鲁氏菌基因组相比，二者表现出难以置信的保守性，全基因组仅有7301个单个碱基对变异，所编码的超过约3000个基因中，仅有77个不同，其中羊布鲁氏菌特有的基因有32个集中位于Ⅰ号染色体11区，猪布鲁氏菌特有的基因中有42个集中位于染色体22区。在羊布鲁氏菌的77个与猪布鲁氏菌不同的基因中，有28个存在于牛布鲁氏菌基因组中[4]。

3 布鲁氏菌生物种/型的鉴定

3.1 PCR技术对布鲁氏菌种/型的鉴定布鲁氏菌分子生物学诊断技术以PCR为主，是目前主要的研究技术。Bricker和Halling[22]通过限制性片段长度多态性聚合酶链反应（cleaved amplification polymorphism sequence-tagged sites,CAPs）技术将牛布鲁氏菌、绵羊附睾布鲁氏菌与其他菌种区分开。Vizcaíno等[23]利用CAPs技术将猪布鲁氏菌与犬布鲁氏菌区别开。Fernández-Lago等[24]用布鲁氏菌16Sr-RNA序列制备荧光核酸探针进行全菌杂交试验，选用3种荧光探针对所有布鲁氏菌属和变种以及9株不同的临床分离的布鲁氏菌进行杂交检测，结果用B9探针可将猪布鲁氏菌2、3、4、5型和几乎全部其他布鲁氏菌种区分开。Cloeckaert等[25]可以将海洋种与其他布鲁氏菌种区分开。Redkar等[26]应用实时荧光定量PCR鉴别了布鲁氏菌的牛、羊、猪3个种。Fayazi等[27]用一个长度为25 bp的引物，经PCR扩增后将猪种和牛种布鲁氏菌鉴别开。Bricker等[28]建立了Bass PCR，筛选牛布鲁氏菌。Hinic等[29]建立实时荧光定量PCR鉴别6个种的布鲁氏菌。López-Goñi等[30]建立了一种多重PCR实验（阶梯法），可鉴别古典布鲁氏菌种，包括海洋种及疫苗株S19、RB51和Rev.1。

3.2 其他技术对布鲁氏菌各种/型的鉴定20世纪70年代，Carlsson等[31]提出用酶联免疫吸附试验诊断羊、猪、绵羊附睾布鲁氏菌，此后至今所做的工作有：Ocampo Sosa等[32]设计以AMOS-ERY和IS711为探针的Southern blot杂交试验鉴别出牛3b、牛5、牛6和牛9型；Le Flèche等[33]应用多位点可变数目串联重复序列分析方法代替了传统分型方法进行种/型鉴定；Whatmore等[34]用依据21个数目可变串联重复序列（variable number of tandem repeats, VNTR）基因座建立的分子亚类鉴定方法——VNTR方法，对布鲁氏菌进行了流行病学追踪和菌株亲缘关系的确定；王远志等[35]利用高变8聚核苷酸DNA指纹技术鉴定绵羊附睾种布鲁氏菌菌株。

4 布鲁氏菌预防的研究现状

对于布鲁氏菌种/型的研究，有利于更好预防布病的流行，尤其对于布鲁氏菌疫情暴发具有深远意义。布鲁氏菌各种/型的疫苗研究对今后布病的防控具有非常重要的价值。针对布鲁氏菌暴发时的各种/型的疫苗研究是目前防控的重点及攻破难点。

4.1 牛种布鲁氏菌19（Br.abortus strain19,S19）疫苗该疫苗制造用菌株是1923年从牛奶中分离获得的，菌株中含有O链的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）能持续刺激机体产生抗体，对牛有一定的保护力，历史上曾将S19株广泛应用于牛的免疫接种。但该菌株能传染人，并会引起怀孕母畜的流产，在公畜中也被限制使用[36]。

4.2 羊种布鲁氏菌Rev.1（Br.melitensis Rev.1,Rev. 1）疫苗Rev.1被认为是一种毒力减弱株，属于光滑型，对牛、羊布鲁氏菌均具有免疫保护力。此菌株作为疫苗仍具有一定的毒力，并且在适当的条件下，毒力可以完全恢复[37-38]。

4.3 猪种布鲁氏菌S2疫苗（Br.suis strain 2,S2）该疫苗是用中国分离株制造的，毒力比S19和Rev.1弱，对猪、牛和羊均能产生良好的免疫。由于其毒力较弱，可以通过口服或肌内注射的方式进行免疫，并且不会导致怀孕母畜的流产，因此在我国被广泛使用。虽然有研究认为，S2的保护率较S19和Rev.1低10%～20%，但大量的动物实验表明，S2能够提供令人满意的保护率，对超强毒的马尔他型布鲁氏菌的攻击能提供40%～60%的保护[39-40]。

4.4 牛种布鲁氏菌45/20（Br.abortus strain 45/20, 45/20）疫苗该疫苗制造用菌株1922年从病牛体中分离，后经豚鼠20次传代后获得粗糙型的减毒株。其优点是LPS结构中无O链，因此免疫动物以后，在其体内检测不到O链的抗体，从而可以避免干扰诊断。该菌株作为疫苗的免疫机制仍不清楚，有研究推断LPS中残留的少量O链在起作用，也有研究认为菌体的一些其他有效蛋白刺激了机体的细胞免疫，但这些猜测都缺乏直接有效的证据。粗糙型的45/20疫苗株最严重的问题是该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，使其毒力恢复为强毒，因此其作为疫苗的安全性仍有争议[41]。

4.5 粗糙型牛种布鲁氏菌株51（rough strain Br. Abortus 5l,RB51）疫苗该疫苗株最初由光滑型牛布鲁氏菌2308株经体外反复传代，并经利福平和青霉素的筛选获得。具有利福平抗性的RB51是当前应用最为广泛的疫苗。多年的实践证明其免疫力和保护力均优于S19，并克服了以往疫苗的一些弱点。动物模型表明RB5l所引起的主要是B细胞介导的体液免疫，所产生的抗体虽不能直接杀死病菌，但机体产生的各种细胞因子却具有杀死病菌的功能，良好的抗体水平能有效地抵制野毒株的感染。研究发现，相对于光滑型牛布鲁氏菌2308株，RB5l在其基因组wboA基因（编码糖基转移酶）中插入了一段Is711成分（大小为842 bp的插入序列）。该序列比较保守，经常出现在布鲁氏菌基因组中，确切功能未知。然而在2308株wboA基因中插入其他转座基因获得的突变株，能提供比RB51更好的免疫保护效果，但毒力比RB51强[42]。

4.6 新型布鲁氏菌DNA疫苗对于布鲁氏菌DNA疫苗的研究方兴未艾，呈现较好的发展势头。特别是伴随布鲁氏菌的全基因组测序完成，开展了保护性抗原分子的DNA疫苗的研究。所选用的抗原分子有外膜蛋白、细菌表面蛋白及核蛋白等。而DNA疫苗的候选分子主要集中在刺激T细胞引起细胞免疫的以下几个分子。

4.6.1 L7/L12 L7/L12是重要的布鲁氏菌免疫优势抗原，在布鲁氏菌的几种保护性抗原基因中，以它为基础构建的疫苗对感染具有最显著的抵抗作用。早在1997年，有学者将L7/L12用pcDNA3做载体制成DNA疫苗，该疫苗能够诱导细胞免疫，并产生特异性抗体，有一定的保护力。但此种DNA疫苗诱导的免疫反应维持时间较短，可能与注射剂量及注射方式有关[43]。

4.6.2 GroEL热休克蛋白在分枝杆菌感染免疫中研究最为广泛，Steller等[44]利用pCMV真核表达载体构建了GroEL，然而经实验证明，此DNA疫苗对布鲁氏菌的攻击无任何保护作用。另外，研究较多的T细胞抗原还有SOD，B细胞抗原中研究最多的有Omp31、BCSP31等。

4.6.3 Opm31 Opm31为一种B细胞抗原，用质粒pNv3123与之构建一重组体，注入Balb/c小鼠体内，实验证明小鼠体内可产生大量的IgG，且在攻毒时有一定的保护力[45]。

5 展望

布鲁氏菌种/型的分类研究是今后研究的重点，尤其是应用分子生物学技术进行布鲁氏菌种/型分类的研究对预防具有积极意义，因其较好的敏感性、特异性及快速性等特点，可作为布病的一个重要诊断方法，具有很广阔的前景。鉴别布鲁氏菌各种/型的技术方法种类繁多，其中应用免疫酶组化法和PCR技术检测临床标本中的布鲁氏菌DNA将成为今后早期、快速诊断布病的发展方向[46]。而VNTR指纹图谱的分子生物学方法能高度区分不同布鲁氏菌生物种/型，因此它可以用于流行病学调查，追踪暴发疫情中病例的来源，从而就能有效地控制传染源及切断传染途径[47]，因此该项技术具有不可忽视的作用，也将是今后研究的重点。利用免疫酶组化法、PCR技术和VNTR指纹图谱进行布鲁氏菌生物种/型的鉴定，将成为今后布病研究领域的一个主要研究方向。布鲁氏菌种/型的鉴定研究对于判断预测疫情动态、研究流行特点、探索掌握流行规律以及制定合理有效的防治对策具有重要意义，同时对布鲁氏菌疫苗的研制和布鲁氏菌新药的开发均有深远的影响作用，尤其在以畜牧业为主的地区，布鲁氏菌的分型对于该区域布病的防控及疫苗的发放具有深远影响。

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（2013-07-25收稿 2013-10-03修回）

（责任编委 李军 本文编辑 张云辉）

Research status of identification of Brucella species/types

YAN Fei,ZHENGWen-yan*,ZHANG Zhuan-cai,QU Fen
Class 5 Internal Medicine Graduate 2012,Inner Mongolia Medical University, Hohhot,the Inner Mongolia Autonomous Region 010010,China
*Corresponding author,E-mail:fyyjbwangyi@sina.com

Brucellosis is a kind of zoonosis which is caused by members of the genus Brucella.World Organization for Animal Health lists it as an important infectious disease.In recent years,the morbidity of brucellosis has been rising.Application of molecular biology techniques to the research of Brucella species/types is of important significance.This article summarizes the research progress of identification of Brucella species/types,which provides evidence for judging and predicting epidemic dynamics, studing epidemic characteristics and making reasonable and effective prevention and control counter-measures.

brucellosis;Brucella;molecular biology;consensus development conferences as topic

R516.7

A

1007-8134(2014)01-0055-05

内蒙古科技厅基金项目（20120404）；内蒙古卫生厅应用基础研究项目（2010045）

010010呼和浩特，内蒙古医科大学2012级内科学研究生临床五班（闫飞）；010000呼和浩特，解放军第二五三医院传染科（闫飞、郑文艳、张专才）；100039北京，解放军第三○二医院临床检验医学中心（曲芬）

郑文艳，E-mail:fyyjbwangyi@sina.com