羟基自由基检测技术方法概述

齐 萌

(华北电力大学科技学院，河北 保定 071003)

1 概述

近年来，高级氧化技术(AOTs)的开发和应用促进了高浓度有机废水降解技术[1]和烟气中有害气体(如NO，Hg0)的氧化脱除技术的发展。高级氧化技术主要包括湿式氧化、电化学氧化、声-电氧化、光催化氧化、电助光催化氧化等，其中最传统的氧化技术是Fenton法[2]。目前，科研工作者认定羟基自由基(·OH)是该技术一种重要中间体。·OH是一种高活性基团，可与众多有机物反应[3]，最终将其降解为H2O和CO2。

羟基自由基存在一个未成对电子，反应活性很强，有极强的氧化能力。在已知强氧化剂中，其标准电极电势仅次于氟[4]，且·OH的反应速率常数高、寿命短[5-6]。·OH是一种高效、无二次污染的强氧化剂[7]。但对于·OH检测，尚无准确有效的直接测定方法，只能用捕捉剂对·OH进行捕获，通过检测加合物来间接检测·OH的数量。因此对捕捉剂的捕获效率、加合物的稳定性和反应性都提出了极高的要求，而实际反应中，捕捉剂对·OH的捕获效率较低。目前，比较成熟的检测方法主要有电子自旋捕集法(ESR)、高效液相色谱法(HPLC)、分光光度法、荧光光度法(FD)、化学发光法(CL)、电化学检测法(ECD)等。

2 检测方法

2.1 电子自旋捕集法(ESR)

电子自旋共振法(Electron Spin Resonance)是从1945年发展起来的,主要研究对象为具有未成对电子的自由基和过渡金属离子及其化合物。而自旋捕集技术(Spin Trapping)是20世纪60年代发展起来的，该技术的建立为自由基的ESR检测技术开辟了新的途径[8]。其原理是利用适当的自旋捕捉剂与·OH加合而形成相对稳定的自旋加合物，再用电子自旋共振波谱法检测自旋加合物的数量，利用自旋加合物的数量来计算·OH的数量。典型的自旋捕集剂是亚硝基化合物或氮氧化合物，DMPO作捕获剂对自由基结构变化相当敏感，可提供其结构的详细信息。

高迎新等[9]以DMPO为捕捉剂测定Fenton/类Fenton反应中·OH变化规律。在相同条件下，与Fenton过程相比，类Fenton在反应起始和过程中，·OH生成速率都要低。耿蓉等[10]以掺硼金刚石为膜电极建立了一种对电极表面产生·OH进行实时监测的原位电化学-ESR方法。Pou等[11]利用紫外灯照射H2O2产生·OH，·OH与CH3CH2OH反应产生CH3CHOH，后用自旋捕捉剂捕获CH3CHOH，用ESR测定自旋加合物。该法可用于生物体内·OH的检测。Stokes等[12]用浸渍有POBN的滤纸捕集空气中的·OH，甲苯萃取后进行ESR测定，检测限为5×104个/cm3。

2.2 高效液相色谱法(HPLC)

高效液相色谱法(HPLC)是一种高效、快速的分离方法，它具有高压、高速、高灵敏度、高检出限的特点，检出限为1×10-9～1×10-11g[13]。分离检测前用捕捉剂捕集·OH，因此捕捉剂不但要能捕获所需测定的·OH，产物也要有一定的稳定性，还要有利于HPLC分离和检测。常用捕捉剂有水杨酸、苯二甲酸、二甲基亚砜、氯苯甲酸等。

王海燕等[14]利用探针化合物氯苯甲酸定量分析电助光催化产生的·OH，结果表明电助光催化过程中的·OH约为光催化过程2倍。E.Lindsey等[15]分别用安息香酸作捕捉剂，分析了二次蒸馏水、含不同体积比Maurepas湖水配制的Fenton体系中的·OH的含量。T.H.Tsai等[16]用HPLC结合微透析技术，实现了在线检测生物体内的·OH。吴建林等[17]以水杨酸为捕获剂，用HPLC间接检测辉光放电等离子体中·OH的含量。杨威等[18]采用HPLC结合库仑阵列多电极检测器体系建立了一套操作简便、高效、快速测定·OH的方法。

2.3 分光光度法

ESR法和HPLC法仪器价格昂贵，一般实验室难以承受，因此光度法是目前国内科研人员常用的检测方法。分光光度法高效、快捷、实用，仪器价格低廉，通过近些年技术发展，光度法已成为一种成熟的检测·OH的方法。光度法是利用·OH与捕捉剂生成一种较为稳定的加合物，由于捕捉剂反应前后吸光度的不同，通过测量吸光度差值来确定·OH的数量的一种方法。常用的捕捉剂有邻二氮菲(Fe(phen)32+)、DMSO、水杨酸、茜素紫、中性红、亚甲蓝、二甲亚砜+监牢蓝(BB)等。

梁月园等[19]用过量KI与·OH反应生成I3离子，再与阳离子表面活性剂(CS)形成疏水性缔合分子并进一步形成(CSI3)n缔合微粒产生新吸收峰，反应温度20～35℃，反应时间15min，pH为5.2时吸光度最大。试验表明以CTMAB为代表的CS可用来检测Fenton体系的·OH。付燕等[20]用Fe(phen)32+光度法测定辉光放电电解过程中产生的·OH，相对标准偏差(RSD)4.1 %。姜艳丽等[21]借助阴离子交换膜，采用Fe(phen)32+分光光度法测定TiO2/Ti光电催化体系中·OH浓度。结果表明在光电催化体系中加上较小的外加偏压(0.6 V)可以有效抑制光生电子和空穴的复合，提高·OH生成率。潘光建等[22]用二甲基亚砜(DMSO)捕集·OH后生成产物甲基亚磺酸(MSA)，再用FBBS与MSA反应生成重氮砜产物，用紫外-可见分光光度仪于420nm处检测。结果表明，高温下DMSO捕集·OH时间不宜过长，捕集反应后应尽快对产物进行测定。任学昌等[23]以水杨酸为分子探针物，用光度法测定纳米TiO2薄膜光催化体系中产生的·OH数量，结果表明：水杨酸自然氧化程度较低，可作为分子探针测定·OH产生。刘瑛等[24]用考马斯亮蓝G250捕捉Fenton反应产生的·OH，考马斯亮蓝因氧化褪色，而褪色程度与·OH的量在一定范围内成正比，据此建立了测定·OH的方法，并应用于植物提取液对·OH清除率的测定。

2.4 荧光光度法(FD)

荧光光度法原理是底物或捕捉剂与·OH反应，诱导底物发光或者使底物发光减弱，通过测定底物发光的强度变化来测定·OH数量的一种方法。荧光光度法(下简称光度法)特点是仪器价廉、分析迅速，但精度、准确度都不高。常用的底物是DMSO+氨/1,3-环已二酮(CHD)、Ce3+、苯基荧光酮、对苯二酸盐(TA)等。

史书杰等[25]用Fenton反应产生的·OH将Ce3+氧化成Ce4+。基于Ce4+与8-羟基喹啉的显色反应，采用流动注射分析(FIA)技术，于室温下间接测定体系中·OH含量。结果表明·OH生成量与苯酚去除率之间具有良好的相关性。该法所需仪器设备简单，操作方便、快速准确，适用于·OH的在线测定。李慧泉等[26]以硝酸钕和钛酸四正丁酯作为前驱体，采用溶胶-凝胶法制备了Nd2O3/TiO2纳米光催化剂，并以对苯二甲酸作为探针分子，以甲基橙为光催化降解反应模型化合物，测定了甲基橙在TiO2和Nd2O3/TiO2(1.0%)光催化剂上的吸附常数。结果表明：Nd2O3掺杂使TiO2粒径减小、比表面积增大，催化剂的催化活性越高，·OH生成速率越大。Chao Tai等[27]利用DMSO捕捉·OH生成甲醛，甲醛再与氨和1,3-环已二酮(CHD)在pH=4.5时反应生成有荧光的物质，根据荧光强度变化测定·OH数量。Ce3+有特征荧光，而被氧化成Ce4+后便失去荧光，因此很多人都以它为介质研究·OH生成量。Boxin O.等[28]以荧光素为探针，用光度法测定了对类Fenton体系中Co(Ⅱ)-H2O2产生的·OH的抑制作用。Fertraud Mark等[29]用超声辐射N2O饱和水溶液而产生·OH，·OH进攻对苯二酸盐(TA)生成具有特征荧光的羟基化产物，再用光度法间接测定·OH。Matt King等[30]用光度法测定CCA与·OH的强荧光产物，间接测定紫外照射H2O2和Fenton体系两种方法产生的·OH数量。杨小峰等[31]用哌啶类氮氧自由基自旋标记荧光探针来表征·OH。·OH先与二甲基亚砜(DMSO)反应，生成甲基自由基，而后甲基自由基被自旋标记荧光探针捕捉，形成强荧光产物，荧光强度的增量AF与反应生成的甲基自由基的量成正比，也与参加反应的·OH的量成正比。

2.5 其他方法

化学发光法(CL)是一种检测·OH的灵敏、准确的方法，原理是发光剂被活性氧自由基氧化成激发态，当其返回基态时放出大量光子，从而对CL起放大作用。自由基产生越多，其发光值就越大，反之亦然，根据发光值大小可反映系统中·OH的量。陈秀武等人[32]用酵母扩增，化学发光法测定抗坏血酸-Cu2+-H2O2体系产生的·OH。体系中H2O2是·OH的前体，酵母是很好的发光底物，能有效地扩增化学发光。反应中·OH攻击酵母，从酵母壁中获取电子，同时伴随化学发光。当体系中存在有机物，则生成的·OH进一步和有机物发生作用，使有机物分解，同时伴随化学发光减弱。Hu等[33]也利用化学发光法找到了适用于空气中ROx自由基(如HO·、HO2·、RO·和RO2·)的原位测定法。

电位滴定法是将电化学和氧化还原滴定结合起来的一种方法，该法利用试剂滴定，建立了一种测定·OH浓度的方法。储金宇等[34]用自动电位滴定仪，建立了检测·OH浓度的新方法，该法测定·OH浓度检出限为5.5×10-6mol/L，相对标准偏差仅为0.19%，灵敏度1.7×104，可用于·OH浓度的精确检测。此法终点判断简单、操作简便、稳定性好、测定快速，可作为高级氧化处理工艺中测定·OH浓度的新方法。

气相色谱法是将加合物进行分离并利用氢离子检测器进行检测，通过测定峰面积来间接测定·OH数量的一种方法。赵宝洪等[35]用水杨酸作·OH捕获剂，得到加成产物二羟基苯甲酸，后者再经衍生化，用气相色谱法测定衍生化产物，从而间接测定·OH量。王炳娟等[36]用Fenton反应产生的·OH氧化二甲亚砜(DMSO)，生成的甲醛经2,4-二硝基苯肼(DNPH)衍生化并用四氯化碳萃取，所得产物(甲醛-DNPH)利用HP-5毛细管柱进行分离，氢火焰离子化检测器检测，通过测定甲醛-DNPH的峰面积可间接定量羟基自由基的产生量。

共振散射光谱法是一种简便、灵敏的分析方法，已用于多种无机物及有机物的分析[37]。有研究表明，金、银纳米微粒存在共振散射效应，已用于共振散射光谱分析，并获得了较好效果。梁爱惠等[37]以柠檬酸三钠做还原剂，采用微波高压法制备了银纳米微粒，纯银纳米微粒的共振散射峰位于470nm处，并且该法用于筛选·OH清除剂，获得了比较满意的结果。

3 结语

从上述分析可知，近些年·OH检测技术日趋成熟，国内外已建立了多种测定·OH的方法，但多数方法仍是间接测定法，而间接测定干扰大，对加合物反应性、稳定性有极高的要求。目前的捕捉剂效率还不能达到足够的准确度和精度。但同时，由于·OH高活泼性、低浓度、寿命短特点，即使进行直接测定，其干扰因素也很多，因此对于·OH检测今后可在以下方向进行努力：

(1)寻求或研制一种新型捕捉剂，提高加合物稳定性，并延长其常温保存时间便于检测。

(2)在加合反应中，应使·OH在短时间内与捕捉剂充分反应，提高捕获效率。

(3)上述方法以间接法居多，今后研究应侧重于直接法。并且，在检测准确的基础上，实现·OH的在线检测是今后研究的方向。

(4)·OH是高效、快速、无二次污染的理想氧化剂，目前对其的应用多为处理有机废水，今后的研究可将其应用到固体废物处理及烟气治理等方面。

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