盐胁迫下豌豆幼苗对内外源NO的生理生化响应

2014-03-26时振振李胜杨柯马绍英刘会杰张品南杨晓明

草业学报 2014年5期

时振振，李胜＊，杨柯，马绍英，刘会杰，张品南，杨晓明

（1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州730070；2.甘肃省农业科学院作物研究所，甘肃兰州730070）

土壤盐渍化也称盐碱化，是指土壤底层或地下水的盐分随毛管水上升到地表，当水分蒸发后，盐分就积累在表层土壤中，对植物的生长发育造成胁迫。土壤盐渍化已成为世界性的环境问题，严重威胁农业和畜牧业的生产。全球将近20%的耕地以及近半数的灌溉地都受到不同程度的盐渍化影响［1－2］。中国盐渍土面积约2亿hm2，主要分布在东北滨海地区以及西北干旱半干旱地区［3－6］。盐胁迫是影响植物生长的重要因子，也是影响作物产量的主要因素［7］。在盐碱胁迫作用下，植物生长会受到抑制［8－10］，植物的光合过程受阻，产生过量活性氧，导致细胞内损伤，甚至死亡［11－13］。豌豆（Pisumsativum）属豆科、豌豆属，英文名Pea或Garden Field Pea，中文又名寒豆、毕豆、国豆、荷兰豆等，是重要的豆科小杂粮作物［14］，中国是世界上第三大干豌豆生产国和第二大青豌豆生产国。近年来，豌豆因其适应性强、用途广泛、营养价值高、经济效益和种植效益好等优点被生产者和消费者越来越关注，种植面积也不断扩大，主要分布在江苏、浙江、湖北、甘肃、青海、内蒙古等20多个省（区、市）［15］。然而，我国西北地区淡水资源缺乏，土壤盐渍化严重［16］，严重影响着豌豆产量和品质，所以探寻减缓豌豆生产中盐胁迫的途径是非常必要的。

一氧化氮（nitricoxide，NO）是一种最新发现且广泛存在于植物细胞内和细胞间的信号分子，参与调节许多生理过程［17－18］。适量浓度的NO可以减轻盐胁迫下植物幼苗生长的抑制作用［19］、维持盐胁迫下细胞膜结构和功能的稳定性以及缓解植物叶片叶绿素的降解和氧化损伤［20－21］，还维持细胞渗透平衡和诱导植物细胞内多种抗氧化酶的活性［22］，从而提高植物的抗逆能力。王芳等［23］研究表明，外源NO对Cd胁迫下玉米（Zeamays）生长有一定的缓解作用，可以增强玉米幼苗对Cd毒害的抗性。张艳艳等［24］指出NO对盐胁迫下玉米幼苗生长所受到的抑制具有缓解作用。张宋智等［25］研究表明，黄金树（Catalpaspeciosa）种子在外源NO供体亚硝基铁氰化钠（SNP）浸种后萌发得到的幼苗耐盐性较优。赵滢等［26］研究表明，外源NO能显著提升盐胁迫下山葡萄（Vitis amurensis）叶片SOD和APX活性，减少 MDA的产生和积累，保护光合机构免受活性氧伤害，从而提高叶片叶绿素含量。谢英赞等［27］发现，在一定程度上缓解盐胁迫对决明（Cassiaspectabilis）幼苗造成的伤害。刘建新等［28］研究表明，NO参与盐胁迫下Pro积累的调控。虽然前人对NO已做较多的研究，但有关内外源NO对盐胁迫下豌豆生长的调节效应及机理还鲜有报道。因此，本文以豌豆为试验材料，研究内外源NO对盐胁迫下豌豆生长的影响，以期揭示NO提高豌豆耐盐的生理机制，为开展豌豆种质资源研究和确立豌豆盐渍地优质高产稳产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与处理

试验于2013年3－6月在甘肃农业大学植物细胞工程实验室进行。供试豌豆品种为耐盐性较弱的“陇豌一号”，由甘肃省农业科学院作物所提供。选取大小一致且无病虫害、颗粒饱满的豌豆种子，流水冲洗20min，1%的84消毒液消毒10min，无菌水冲洗4次，吸水纸吸干后播种于盛有灭过菌的蛭石培养钵中（直径15cm），移至光照培养箱［光照12h/d，温度（23±1）℃，空气相对湿度80%，光通量密度400μmol/m2·s］进行发芽培养，每2 d浇灌一次1/2Hoagland营养液。待4、5片真叶展开后，挑选长势一致的幼苗，开始以下浇灌处理（处理液的pH 均为7）：1）CK （1/2Hoagland 营养液）；2）NO （100μmol/L SNP）；3）NaCl（100mmol/L NaCl）；4）NaCl＋NO （100mmol/L NaCl＋100μmol/L SNP）；5）NaCl＋SF（100mmol/L NaCl＋100μmol/L亚铁氰化钠）；6）NaCl＋c－PTIO（100mmol/L NaCl＋100μmol/L 2－4－羧苯基四甲基咪唑烷－1－氧－3－氧化物）；7）NaCl＋c－PTIO＋NO （100mmol/L NaCl＋100μmol/L c－PTIO＋100μmol/L SNP）。每次每盆浇50mL，连续处理8d后取豌豆幼苗植株进行各项生理指标测定。

1.2 测定指标与方法

处理结束后，每处理随机选取30株幼苗，分别测量胚根长和胚芽长（胚根、胚芽长采用精度0.1mm的游标卡尺直接测量），测定地上部和地下部干重（95℃杀青10min，65℃下烘至恒重并称重），求平均值，根冠比通过根系干重/地上部干重计算。叶绿素含量测定采用丙酮乙醇混合法［29］；可溶性蛋白测定采用考马斯亮蓝G－250法［29］；可溶性糖含量测定采用蒽酮比色法［29］；超氧化物歧化酶（SOD）测定采用氮蓝四唑（NBT）法［30］；过氧化物酶（POD）测定采用愈创木酚法［30］；过氧化氢酶（CAT）测定采用紫外分光光度法［30］。叶片质膜相对透性的测定采用电导仪法［30］。相对电导率＝R1/R2×100%，R1为处理后测得的电导率；R2为处理并煮沸后测得的总电导率；丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸（TBA）显色法［31］；脯氨酸（Pro）含量测定采用茚三酮显色法［31］，每处理重复3次。

1.3 数据分析

用Excel 2003软件处理数据和绘图，SPSS 13.0软件进行统计分析，用Duncan’s新复极差法进行差异显著性检验（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下豌豆幼苗生长对NO的响应

在幼苗生长过程中，胚根长和胚芽长是反映幼苗生长的关键指标。由表1可知，与对照CK相比，外源NO对豌豆幼苗胚芽和胚根生长无显著影响，而盐胁迫则显著抑制了胚根和胚芽的生长。与NaCl处理相比，添加外源NO能显著提高胚根长和胚芽长，NaCl＋NO处理使胚芽长增加25.34%，胚根长增加38.26%（P＜0.05），而NaCl＋c－PTIO＋NO处理较NaCl＋NO抑制了胚芽及胚根的伸长，说明外源NO能缓解盐胁迫对二者的抑制作用。此外，盐胁迫下用NO清除剂c－PTIO处理胚芽长显著低于NaCl处理，这表明内源NO可能也参与盐胁迫的缓解作用。

盐胁迫和NO处理对豌豆幼苗的干重和根冠比也有显著影响。与CK相比，添加外源NO对豌豆幼苗的干重和根冠比无明显效应。NO能显著增加盐胁迫下豌豆地上部和地下部干重以及根冠比。NaCl处理明显降低了豌豆幼苗的干重（P＜0.05），而NaCl＋c－PTIO＋NO处理使地上部干重高于NaCl处理但低于NaCl＋NO处理，但其地下部干重无明显差异。说明外源NO能缓解盐胁迫阻碍豌豆幼苗干重的增加。NaCl＋c－PTIO处理使干重显著低于NaCl处理（P＜0.05），表明内源NO也参与了该缓解过程。同时，与NaCl处理相比，添加NO显著增加了盐胁迫下的根冠比。

表1 NO对盐胁迫下豌豆幼苗胚芽和胚根长的影响Table 1 Effects of NO on length of germ and radical of pea seedling under salt stress

2.2 NO对盐胁迫下豌豆幼苗叶绿素含量的影响

由图1可以看出，与CK相比，添加外源NO对豌豆幼苗叶片的叶绿素含量没有影响。NaCl处理显著降低了叶绿素含量，添加外源NO能显著提高盐胁迫下豌豆幼苗叶片的叶绿素含量，NaCl＋c－PTIO＋NO处理下叶绿素含量显著低于NaCl＋NO处理，NaCl＋NO处理较NaCl处理和NaCl＋c－PTIO＋NO处理下叶绿素含量分别增加了44.23%和19.68%（P＜0.05）。这说明外源 NO能缓解盐胁迫对豌豆植株光合的抑制作用。NaCl处理与NaCl＋c－PTIO处理叶绿素含量无显著差异，表明内源NO对豌豆植株光合作用无明显调节作用。

图1 NO对盐胁迫下豌豆幼苗叶绿素含量的影响Fig.1 Effects of NO on chlorophyll content of pea seedling under salt stress

2.3 NO对盐胁迫下豌豆幼苗可溶性蛋白含量、可溶性糖含量和Pro含量的影响

由图2可以看出，非盐胁迫下，添加NO对豌豆幼苗叶片中可溶性蛋白含量无明显影响。NaCl处理使豌豆叶片中可溶性蛋白含量降低22.43%，盐胁迫下添加外源NO可使豌豆幼苗叶片可溶性蛋白含量显著增加。NaCl＋c－PTIO＋NO处理较NaCl胁迫对可溶性蛋白含量无明显影响，说明外源NO参与可溶性蛋白合成的调节。而NaCl＋c－PTIO处理与NaCl处理下可溶性蛋白含量无显著差异，表明内源NO对可溶性蛋白合成无明显调节作用。

与CK相比，添加NO对豌豆幼苗叶片中可溶性糖含量无明显影响。NaCl胁迫下可溶性糖含量降低25.43%（P＜0.05），添加外源NO可使盐胁迫下豌豆幼苗叶片中可溶性糖含量显著增加（P＜0.05）。NaCl＋c－PTIO＋NO处理较NaCl胁迫对可溶性糖含量无明显影响，说明外源NO参与可溶性糖合成的调节。NaCl＋c－PTIO处理时可溶性糖的含量急剧下降，与NaCl处理差异显著且添加NO能逆转盐胁迫下c－PTIO对豌豆叶片可溶性糖含量的影响，表明内源NO参与可溶性糖含量的调节。

外源NO处理与CK相比，豌豆幼苗叶片脯氨酸含量无显著变化。NaCl处理明显提高了豌豆叶片的脯氨酸含量（P＜0.05），NaCl＋NO处理也明显提高了盐胁迫时豌豆叶片的脯氨酸含量（P＜0.05），且比NaCl处理高23.63%，而NaCl＋c－PTIO＋NO处理下脯氨酸含量显著低于NaCl＋NO处理。由此说明外源NO促进了盐胁迫下豌豆叶片脯氨酸的合成。NaCl＋c－PTIO处理下脯氨酸含量与NaCl处理无显著差异，表明内源NO对脯氨酸的合成无明显调控作用。

图2 NO对盐胁迫下豌豆幼苗可溶性蛋白（A）含量、可溶性糖（B）含量和Pro（C）含量的影响Fig.2 Effects of NO on soluble protein（A）content，soluble sugar（B）content and Pro（C）content of pea seedling under salt stress

2.4 NO对盐胁迫下豌豆幼苗SOD、POD、CAT活性的影响

由表2可看出，与CK相比，NO处理下豌豆叶片中SOD活性无明显变化。NaCl处理下，豌豆幼苗叶片中SOD活性明显低于对照CK（P＜0.05），NaCl＋NO处理则明显增加了盐胁迫下豌豆幼苗叶片SOD活性（P＜0.05），而NaCl＋c－PTIO＋NO处理下SOD活性则显著低于NaCl＋NO，说明外源NO提高了盐胁迫下豌豆幼苗叶片SOD的活性。NaCl＋c－PTIO处理加剧了盐胁迫对SOD活性的抑制，说明内源NO也参与SOD活性的调节。NO处理和NaCl胁迫均使豌豆幼苗POD活性低于CK。与NaCl处理相比，NaCl＋NO处理使得POD活性显著增加，而NaCl＋c－PTIO＋NO处理下POD活性与NaCl处理无显著差异，表明外源NO提高了盐胁迫下豌豆幼苗叶片中POD的活性。NaCl＋c－PTIO处理与NaCl处理下POD活性无显著差异，表明内源NO对豌豆幼苗叶片中POD活性无明显调节作用。NO处理对豌豆幼苗叶片中CAT活性较CK无明显效应。在NaCl处理下，豌豆幼苗叶片CAT的活性明显降低（P＜0.05），NaCl＋NO处理使CAT活性明显增高。NaCl＋c－PTIO＋NO处理下CAT活性显著低于NaCl＋NO处理，说明外源NO增加了盐胁迫下豌豆幼苗叶片的CAT活性。NaCl＋c－PTIO处理下CAT活性显著低于NaCl处理，表明内源NO也参与了盐胁迫下豌豆幼苗叶片中CAT活性的调控。

表2 NO对盐胁迫下豌豆幼苗SOD、POD、CAT活性的影响Table 2 Effects of NO on the activity of SOD，POD and CAT of pea seedling under salt stress

2.5 外源NO对盐胁迫下豌豆幼苗叶片质膜相对透性和丙二醛含量的影响

由图3A可知，NO处理下豌豆幼苗叶片质膜相对透性与CK无显著差异。NaCl胁迫使质膜相对透性增大，且明显高于CK（P＜0.05），NaCl＋NO处理较NaCl胁迫使豌豆叶片的质膜相对透性降低，降低了32.62%（P＜0.05），NaCl＋c－PTIO＋NO处理下质膜相对透性显著低于NaCl＋NO处理，说明外源NO能缓解盐胁迫下豌豆幼苗叶片质膜的相对透性。而NaCl处理与NaCl＋c－PTIO相比，质膜相对透性无显著差异，表明内源NO对豌豆幼苗叶片质膜相对透性无明显调控作用。从图3B可以看出，NO处理下豌豆叶片MDA含量与CK差异不显著。NaCl处理下，豌豆幼苗叶片的MDA含量显著高于CK（P＜0.05）。而NaCl＋NO处理可以明显降低盐胁迫下豌豆叶片MDA的含量（P＜0.05），并且NaCl＋NO处理下MDA含量显著低于NaCl＋c－PTIO＋NO，说明外源NO可以缓解盐胁迫造成的豌豆幼苗叶片中MDA含量的增加。NaCl＋c－PTIO处理促进了盐胁迫下MDA含量的增加，表明内源NO也参与盐胁迫下豌豆叶片中MDA合成的调控。

图3 不同处理下豌豆幼苗叶片质膜相对透性（A）和MDA（B）含量的变化Fig.3 The membrane relative permeability and MDA content of pea seedlings leaves with different treatments

3 讨论

盐胁迫能对幼苗生长产生一定抑制作用，破坏细胞膜的完整性、影响有关物质的积累，改变某些酶的功能［32］。而外源NO能作为一种信号分子促进胚芽和胚根生长，增加生物量，减少非生物胁迫下植物体内ROS的积累，缓解各种胁迫造成的氧化损伤，从而增强植物的适应能力［33］。

1）盐胁迫下，植物的生长及生理指标会受到一定的影响。实验表明，外源NO供体SNP能显著促进盐胁迫下豌豆种子胚根和胚芽生长，增加幼苗干物质积累以及根冠比，并且显著增加了豌豆叶片叶绿素含量，表明外源NO有助于维持豌豆叶片的叶绿素含量，提高了叶片细胞的渗透调节能力和耐盐能力，蒋明义等［34］证实渗透胁迫下叶绿素的降解主要由活性氧的氧化损伤引起，所以NO消除了大量的活性氧，从而缓解了盐胁迫带来的氧化损伤，促进了叶绿素的合成。

2）植物通过可溶性蛋白和可溶性糖的积累来维持细胞的渗透平衡，从而缓解盐离子的毒害作用［35］。本试验中，盐胁迫显著降低了豌豆幼苗叶片中可溶性蛋白和可溶性糖含量，添加外源NO能使可溶性蛋白和可溶性糖含量显著升高。脯氨酸积累是植物对逆境胁迫的一种重要的防护机制，脯氨酸不仅作为渗透调节物质，还包括在清除ROS，提高抗氧化能力，稳定大分子结构，降低细胞酸性以及解除氨毒等方面起重要作用［36］。本研究表明，NO处理可明显提高NaCl胁迫下豌豆幼苗叶片的脯氨酸含量，这和吴雪霞等［37］的结论一致。这表明外源NO缓解了盐胁迫对豌豆幼苗的抑制作用。

3）逆境胁迫下，植物体内产生大量活性氧（ROS），对植物造成伤害，SOD是清除生物体内O2－·的唯一酶类，POD和CAT是植物体内H2O2的清除酶。SOD、POD、CAT等保护酶类在植物体内协同作用，在逆境胁迫中清除过量的ROS，维持ROS的代谢平衡，保护膜结构，从而使植物在一定程度上忍耐、减缓或抵御逆境胁迫伤害［38］。最近研究发现，NO作为一种信号分子对植物逆境生理起重要作用，主要与其对ROS代谢的调节有关，外源NO可以诱导植物细胞内多种抗氧化酶类的活性，从而提高植物的抗逆能力［39］。本研究发现，0.1mmol/L SNP可不同程度地提高盐胁迫下豌豆叶片SOD、POD、CAT的活性，这与焦娟等［40］和郁继华等［41］报道结论一致。但NO对盐胁迫下豌豆叶片3种保护酶的诱导效果并不相同，这可能与盐胁迫下SOD、POD和CAT在膜脂过氧化途径中产生的位置以及NO对3种保护酶活性的调节机制不完全相同有关［42－43］。

4）细胞膜是受逆境胁迫最敏感的部位之一，盐胁迫会对细胞膜造成膜脂过氧化伤害，并使膜的透性增大，导致膜内物质向外渗漏，并最终引起细胞死亡，而MDA是膜脂过氧化的指标。本研究结果表明，外源NO供体SNP处理明显降低了NaCl胁迫下豌豆幼苗叶片的质膜相对透性，同时明显降低叶片中MDA的含量，这与肖强和郑海雷［44］的结论一致。从而证实了外源NO可以缓解盐胁迫造成的豌豆幼苗叶片的膜脂过氧化，对细胞膜具有保护和修复作用，可减轻或防止膜系统的过氧化伤害，这与芦翔等［45］的研究结果一致。

5）亚铁氰化钠是SNP的类似物，在生物体中分解后除不产生NO外，其他产物与SNP相同，结果表明：盐胁迫下用亚铁氰化钠处理豌豆幼苗对胚芽和胚根生长、干物质积累、叶绿素含量、可溶性蛋白和可溶性糖含量、抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）与NaCl胁迫均无明显差异，说明缓解盐胁迫对植物生长抑制发挥作用的是NO，这与郁继华等［41］、周万海等［46］、樊怀福等［47］的研究结果相同。用NO清除剂c－PTIO处理加剧了盐胁迫对豌豆幼苗生长的抑制，如胚芽干重、SOD活性、CAT活性、可溶性糖含量均降低，MDA含量增高。

4 结论

内外源NO均能缓解盐胁迫对豌豆幼苗生长的抑制。非盐胁迫下，外源NO对豌豆胚芽和胚根生长、幼苗干重以及叶片中叶绿素含量、可溶性蛋白和可溶性糖含量、MDA和Pro含量、SOD和CAT的活性及质膜相对透性均无显著影响。NaCl胁迫下，施加外源NO促进了胚芽、胚根的生长并增加了幼苗干重、根冠比和叶绿素的含量；显著降低了豌豆幼苗叶片中膜脂过氧化产物MDA的含量，维持盐胁迫下细胞膜结构和功能的稳定，增加了豌豆幼苗叶片中Pro含量以提高细胞内渗透调节物质的含量和组织持水能力，来缓解盐胁迫对豌豆幼苗的伤害。此外外源NO通过可溶性蛋白和可溶性糖的累积来协调细胞与外界的渗透平衡，从而缓解盐离子的毒害。内源NO对盐胁迫下豌豆幼苗生长也有一定的调控作用，如胚芽生长和干重的调节，可溶性糖、膜脂过氧化产物MDA含量的调节以及SOD、CAT活性的调节。

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