两种方法在二斑叶螨电压门控钠离子通道基因突变检测中的应用

杨顺义，岳秀利，王进军，沈慧敏＊，郭金梅，沈一凡，周兴隆

（1.甘肃农业大学草业学院 草业生态系统省部共建教育部重点实验室 中－美草地畜牧业可持续发展中心，甘肃 兰州730070；2.西南大学植物保护学院 昆虫学及害虫控制工程重点实验室，重庆400716）

二斑叶螨（Tetranychusurticae）是一种世界性害螨，可危害1100多种寄主植物，除了粮食作物、果树、花卉、蔬菜等以外，还可以危害城市绿地植物和牧草，且随着全球变暖，该叶螨在部分寄主植物上的危害有逐渐加重的趋势［1－3］。二斑叶螨由于体型较小、世代周期短、抗逆性强等特点，抗性发展迅速［4］，对多种农药尤其是甲氰菊酯已产生严重的抗药性。甲氰菊酯属拟除虫菊酯类杀虫杀螨剂，作用靶标为电压门控钠离子通道（voltage－gated sodium channels，VGSCs），VGSCs是一种较大的跨膜蛋白，包括4个同源结构域（I－IV），每个结构域由6个跨膜螺旋（S1－S6）组成。VGSCs的不敏感性主要由跨膜螺旋或连接处的点突变引起，主要发生在ⅡS4－ⅡS6和ⅢS6上［5］，并且有的突变与击倒抗性和超击倒抗性有着密切联系。至今，在蛛形纲蜱螨类以及其他昆虫抗拟除虫菊酯种群靶标基因VGSCs的点突变已有很多报道。在二斑叶螨抗性种群VGSCs基因中只发现3个突变，即L1022V、A1215D和F1538I，并且L1022V和F1538I突变对击倒抗性起着主要作用［6－7］。在朱砂叶螨（T.cinnabarinus）抗甲氰菊酯种群中同样发现存在F1538I突变［8］；在蜂螨（Varroadestructor）中，VGSCs上也有4个突变F758L，L826P，I982V和M1055I［9］，而电生理的研究表明L826P突变对氯氟胺氰戊菊酯敏感性降低起着重要的功能作用［10］。在家蝇（Muscadomestica）的VGSCs中，最常见的L1014F/H/S突变在击倒抗性和超击倒抗性种群中都存在，而M918T突变只存在于超击倒抗性种群中［11－13］。靶标VGSCs基因突变是害螨及昆虫对拟除虫菊酯类药剂产生抗性的主要机制。

目前，基因突变检测的方法很多，主要有焦磷酸直接测序（direct pyrosequencing，DS），单链构象多态性分析（single stranded conformation polymorphism，SSCP），限制性片段长度多态性聚合酶链反应（polymerase chain reaction－restriction fragment length polymorphism，PCR－RFLP）以及实时荧光定量PCR（real－time quantitive PCR，RT－qPCR）和毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）［14］等。高明等［15］通过克隆测序发现甜菜夜蛾（Spodopteraexigua）抗性种群钠离子通道基因ⅡS6上存在L1014F突变。各种检测方法优缺点不一，有必要寻找一种经济、灵敏且有效的突变检测方法。本研究采用PCR产物直接测序法与PCR－RFLP两种不同的方法对田间采集的二斑叶螨种群VGSCs基因进行突变位点的检测，旨在建立二斑叶螨对菊酯类农药抗性的分子检测方法，为二斑叶螨的抗药性治理提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试二斑叶螨

二斑叶螨相对敏感种群（susceptible strain，SS）：2007年6月底采自甘肃省兰州市兴隆山国家级森林公园金花忍冬（Lonicerachrysantha）上。在室内采用叶碟法（培养皿底部垫有浸水和表面铺一黑布的海绵，黑布上放用脱脂棉包围的豇豆叶片）进行单对（挑一雌一雄在叶碟上饲养，不接触任何药剂）繁殖，待种群扩大后转移到盆栽豇豆（Vignaunguiculata）苗上扩繁。田间抗性种群：LZ－R和WW－R种群于2012年8月分别采集于甘肃省兰州市和武威市田间种植的茄子（Solanummelongena）和南瓜（Cucurbitamoschata）上，待种群在室内扩繁定殖后，测定其对甲氰菊酯的抗性分别达到27.4和23.1倍。以上二斑叶螨SS、WW－R和LZ－R种群饲养在养虫室盆栽的豇豆苗上。控制条件：温度（26±1）℃，相对湿度（75±5）%，光照14h，黑暗10h。

1.2 主要药剂及仪器

20%甲氰菊酯乳油（红太阳农药集团有限公司），RNA提取试剂盒RNeasy?Plus Micro Kit（Qiagen公司），反转录试剂盒PrimerScript?RT Reagent Kit，rTaq酶等PCR相关试剂（TaKaRa公司），限制性核酸内切酶Sau3AI和BclI（Thermo公司），S1000TMThermal Cycling PCR仪（Bio－Rad公司），PowerPac Basic电泳仪（Bio－Rad公司），Universal Hood II凝胶成像仪（Bio－Rad公司），Nanovue核酸浓度测定仪（GE Healthcare公司）。

1.3 二斑叶螨总RNA提取

于2012年9月分别挑取SS、WW－R和LZ－R种群的二斑叶螨雌成螨约500头，按照Qiagen公司RNA提取试剂盒RNeasy?Plus Micro Kit使用说明书提取总RNA，具体操作步骤如下：

1）预先将研钵用液氮进行多次冷冻，之后加入待研磨样品，反复研磨，再加入350μL Buffer RLT plus继续研磨均匀，转移至2mL离心管；

2）将离心管置离心机中13000r/min离心3min，吸取上清液，记住大致体积V，转移到gDNA Eliminator spin column离心管，10000r/min离心30s，丢掉柱子保存液体；

3）在上述液体中加入V体积的70%酒精，混匀；

4）转移上述液体至RNeasy MinElute spin column离心管中，盖严盖子，10000r/min离心15s；

5）在RNeasy MinElute spin column离心管中加入700μL Buffer W1，盖严盖子，10000r/min离心15s；

6）在RNeasy MinElute spin column离心管中加入500μL Buffer RPE，盖严盖子，10000r/min离心15s；

7）在RNeasy MinElute spin column离心管中加入500μL的80%酒精，盖严盖子，10000r/min离心2min；

8）空离。将柱子放入一新的2mL离心管里，开盖，13000r/min离心5min。

9）洗脱RNA。将柱子放入一新的1.5mL的收集管中。在柱子膜中央加入20μL RNase－free water，轻轻盖上盖子，13000r/min离心1min，弃柱子，得到的即所需RNA。

对提取得到的总RNA经Nanovue核酸浓度测定仪测定其浓度时，依照A260/280和A260/230的值确定RNA纯度；RNA纯度确定后进行琼脂糖电泳胶电泳，根据条带的数目及亮度检测RNA的完整性。最终，选取A260/280在1.8～2.2之间，A260/230在2.0～2.4之间的RNA样品保存于－80℃冰箱，备用。

1.4 反转录合成第一链cDNA

将提取得到的二斑叶螨SS、WW－R和LZ－R总RNA分别反转录合成第一链cDNA，方法参照Takara公司反转录试剂盒PrimerScript?RT Reagent Kit Perfect Real time试剂盒说明书进行。反应体系10μL：5×Prime－Script?Buffer（for Real Time），2μL；PrimeScript?RT Enzyme Mix I，0.5μL；Oligo dT Primer（50μmol/L），0.5μL；Random 6mers（100μmol/L），0.5μL；总RNA不超过0.5μg；最后补充RNase Free dH2O至10μL。待所有样品加完后，将其放入PCR仪中37℃反转录反应15min，85℃反转录酶失活反应5s。反应完毕后，测定cDNA浓度，将反转录产物保存于－20℃冰箱，备用。

1.5 引物设计

根据二斑叶螨在线基因组数据库（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/bogas/overview/Tetur）中VGSCs基因（基因登录号：Tetur34g00970）全长序列以及该基因序列上报道存在的F1022V、A1215D和F1538I突变等信息，用Primer 5.0软件分别设计用于靶标位点VGSCs上F1022、A1215和F1538基因片段扩增的特异性引物以及PCR－RFLP反应的引物，引物名称、片段长度及用途见表1。

表1 用于PCR扩增的特异性引物及其用途Table 1 Specific and quantitative primers and their use in the experiment

1.6 PCR反应及产物的测序

用于扩增二斑叶螨钠通道相关突变基因的PCR反应体系为25μL，其中10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2（25 mmol/L）2.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2μL，ddH2O 14.8μL，rTaq酶（5U/μL）0.2μL，上下游引物（10 μmol/L）各1μL，cDNA模板（二斑叶螨不同种群的cDNA）1μL。扩增条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸1min，共35个循环；最后72℃延伸10min。PCR反应产物经1%琼脂糖凝胶电泳，若检测到目的条带，且条带单一、明亮，则可以直接进行测序。试验重复3次。

1.7 突变位点的PCR－RFLP法检测

A1215D突变位点的检测：采用PCR－RFLP法扩增目的片段，扩增产物用限制性核酸内切酶消化成不同大小的片段，直接在琼脂糖凝胶电泳上分辨。应用Primer 5.0软件进行酶切位点的寻找，不同种群的PCR扩增产物经内切酶Sau3AI酶切处理，识别位点为↓GATC。WW－R和LZ－R种群若发生GCT→GAT突变，就会产生一个酶切位点↓GATC，能被Sau3AI酶切消化产生498和99bp两条带，而SS种群由于是正常碱基，不存在相应的识别位点，不能被内切酶消化，只有597bp的条带。酶切后产物在2%的琼脂糖凝胶上电泳，根据片段的位置、大小即可鉴定出A1215D突变存在与否。试验重复3次。

F1538I突变的检测：由于F1538I突变位点附近没有合适的酶切位点，根据创造酶切位点原理［16－17］，将引物3′端最后一个碱基错配引入一个酶切位点T↓GATCA，即将突变碱基前一个碱基T人为的更改为G，并在此处设计引物（表1）。WW－R和LZ－R种群若发生TTC→ATC突变，就会产生一个酶切位点T↓GATCA，能被BclI酶切消化产生277和20bp两条带，而SS只有297bp一条带，酶切后在2%的琼脂糖凝胶上电泳，根据片段的大小、位置即可鉴定出F1538I突变的存在与否。试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 二斑叶螨VGSCs基因片段扩增及测序

2.1.1 突变位点区域片段扩增 二斑叶螨SS、WW－R和LZ－R种群VGSCs基因L1022、A1215和F1538位点片段扩增序列经琼脂糖凝胶电泳如图1，3种群扩增产物条带单一、明亮，均为目的片段，符合PCR产物直接测序的基本要求。

图1 二斑叶螨不同种群突变位点扩增电泳图Fig.1 Electrophoretogram of mutation sites in different strains of T.urticae

2.1.2 VGSCs基因PCR产物测序结果 根据二斑叶螨SS、WW－R和LZ－R种群A1215和F1538位点部分基因片段测序结果表明，与二斑叶螨SS种群VGSCs基因核苷酸相比对，WW－R和LZ－R种群均存在点突变，第一个突变位点在结构域ⅡS6和ⅢS1连接处，GCT（丙氨酸）被GAT（天冬氨酸）取代，即存在A1215D突变；第二个突变发生在结构域ⅢS6处，TTC（苯丙氨酸）被ATC（异亮氨酸）取代，即存在F1538I突变，其中 WW－R种群中F1538I为纯合突变，而LZ－R中为杂合突变。然而，L1022V突变在二斑叶螨WW－R和LZ－R种群均未检测到。

2.2 二斑叶螨VGSCs基因突变PCR－RFLP检测

2.2.1 A1215D突变位点的PCR－RFLP检测 采用PCR－RFLP的方法进行酶切鉴定二斑叶螨 WW－R和LZ－R种群A1215D突变。通过Sau3AI酶切处理SS、WW－R和LZ－R种群后，发现 WW－R和LZ－R种群均能被内切酶切开，产生498和99bp两条带，而SS种群只有一个597bp的条带（图2）。酶切前后根据条带的位置、数目可以明显的区分突变种群，但由于99bp的条带太暗凝胶成像显示不清晰，而498和597bp两条带区分明显，并不影响突变位点的鉴定，说明二斑叶螨WW－R和LZ－R种群中都存在A1215D氨基酸突变，而根据酶切结果电泳图没有发现WW－R和LZ－R种群中存在杂合现象。

2.2.2 F1538I突变位点的检测 采用错配碱基引入酶切位点改进的PCR－RFLP方法进行F1538I的突变检测，结果表明酶切前后WW－R和LZ－R种群条带大小、位置没有发生变化，与SS种群没有明显差异（图3），即没有被BclI内切酶消化。为了排除是由于酶切前后电泳条带在2%浓度琼脂糖凝胶电泳条件下不易区分引起的，通过增加琼脂糖凝胶电泳的浓度试验结果相同；最后通过PCR产物测序发现，错配碱基的引入会导致下游片段引物延伸时突变碱基处产生差异，从而不能形成BclI识别的酶切位点，即PCR－RFLP法不能有效地检测出WW－R和LZ－R种群的F1538I突变。

图2 二斑叶螨不同种群A1215D突变酶切电泳图Fig.2 Electrophoretogram results of the A1215Dmutation in different T.urticae strains with enzyme digestion

图3 二斑叶螨不同种群F1538I突变酶切电泳图Fig.3 Electrophoretogram results of the F1538Imutation in different T.urticae strains with enzyme digestion

3 讨论

目前，在二斑叶螨抗性种群VGSCs基因上发现存在L1022V、A1215D和F1538I共3个氨基酸突变。通过功能分析表明L1022V和F1538I突变在二斑叶螨对拟除虫菊酯类农药的不敏感性起重要作用［6，18］，并且F1538I突变被认为是对拟除虫菊酯具有最高效的抗性位点之一［19－20］，是家蝇钠通道ⅢS6螺旋处的芳香族氨基酸残基，同时也是拟除虫菊酯的疏水性结合位点［21－22］；而A1215D突变的功能尚不明确，还需要进一步的研究。本研究发现，田间采集的二斑叶螨WW－R和LZ－R种群对甲氰菊酯抗药性的产生与F1538I突变有关，F1538I突变是二斑叶螨对甲氰菊酯产生高抗性的重要原因；这与前期本实验室研究室内饲养的二斑叶螨经甲氰菊酯抗性培育45代后，同样会产生F1538I突变的结果一致［23］。说明田间和室内的二斑叶螨在甲氰菊酯药剂的胁迫作用下，其靶标VGSCs基因均会产生同样的突变，从而对其高抗性的产生起着重要作用。随着二斑叶螨全基因组的发布，突变的检测将更有利于对其抗性分子机理以及抗药性检测的研究［24］，其中与代谢相关的二斑叶螨水平基因转移［25］以及二斑叶螨对寄主植物的适应性与抗药性的关系［26］最近已有报道。因此，从分子水平上检测拟除虫菊酯类农药靶标VGSCs突变，对相关的抗性机理研究具有重要意义。

通过比较两种突变检测方法，PCR－RFLP法虽然较快速方便，不需要测序，但是由于酶切位点以及内切酶价格的限制，并且只能在已知突变的情况下才能采用，这在一定程度上限制了该技术的使用，并且错配碱基创造酶切位点的方法在碱基错配后，有时可能会导致下游1～2个碱基不能正常扩增配对，降低了酶切鉴定的敏感度，本研究采用此方法则不能有效地检测出F1538I突变。相对于PCR－RFLP法，通过PCR产物正反双向直接测序，可以检测出二斑叶螨突变位点A1215D和F1538I，并能明确突变碱基类型，重复性更好，结果更准确，但操作相对繁琐，测序较耗时；而其他方法如高通量融解曲线法［27］等由于仪器昂贵，成本较高，也不适合一般实验室采用。熊亮等［28］通过比较PCR产物直接测序法和高通量溶解曲线分析技术检测胶质瘤表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突变类型发现，这两种方法在检测EGFR外显子19突变率具有较高的一致性。因此，伴随着新一代高通量分子测序技术的不断进步和发展，测序周期将大大缩短，PCR产物直接测序法将更有利于害螨及昆虫抗药性的突变检测。

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