大孔树脂纯化酸石榴汁中花青素的研究

赵贝塔，赵 巍，刘邻渭，谢 乐

(1 西北农林科技大学 食品科学与工程学院，陕西 杨凌 712100；2 中国科学院水利部水土保持研究所 黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室，陕西 杨凌 712100)

花青素是一类广泛存在于植物中的水溶性天然色素，属黄酮化合物，主要分布于植物叶片、花或种子的叶肉细胞和表皮细胞的液泡中，使植物器官发生从红色到黑色的变化[1-4]，因而将其作为绿色健康的食品色素添加剂具有广泛的应用前景。酸石榴为石榴科植物石榴(PunicagranatumLinn)带味酸的果实，我国南北各地都有种植。石榴果汁中含有3种花青素苷元和9种花青素苷，花青素苷的平均含量为60.0 mg/L(以矢车菊素-3-葡糖苷(Cy3G)为标准物)[5]；《本草纲目》中记载：“榴者，天浆也，止泻痢、下血、脱肛、崩中带下”[6]，其中的部分功效即与其所含花青素类物质有关。

大孔吸附树脂法根据吸附性和分子筛原理，可以实现具有一定极性的有机大分子物质的分离，该方法具有吸附选择性好、处理容量大、解吸条件温和、使用周期长、成本低等优点，适合于工业化生产[7-9]。中药材的大孔树脂纯化工艺在我国已有初步研究[10-11]，但对酸石榴汁花青素的纯化鲜见报道。本试验开展酸石榴汁花青素纯化树脂的筛选及吸附-解吸性质的研究，探讨AB-8树脂分离纯化酸石榴汁花青素的工艺条件，以期为石榴汁花青素工业化生产工艺的建立及优化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验原料 新鲜酸石榴，2012-10采自陕西临潼韵鲜果品专业合作社石榴园。

1.1.2 仪器与设备 PHS-3C pH计，上海精科；JA2003电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；UV-2550型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；7230G分光光度计，上海精科； LD4-2低速离心机，北京医用离心机厂；TSQ-280振荡器，上海精宏实验设备有限公司；SHB-Ⅱ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司。

1.1.3 供试树脂 大孔树脂AB-8、X-5由天津光复精细化工研究所生产；D101、D101A、NKA-9，天津海光化工有限公司生产。其具体性能参数见表1。

表1 供试5种大孔吸附树脂的理化性质

1.2 试验方法

1.2.1 酸石榴汁的制备 将酸石榴表面洗净擦干，手工去皮、剥出籽粒，用手工榨汁机取汁，混匀后，用孔径0.105 mm滤布过滤，4 000 r/min 离心10 min，收集上层石榴汁清液，于 -20 ℃冻藏备用。

1.2.2 酸石榴汁紫外-可见吸收光谱的测定 参照文献[12-13]的方法，将酸石榴汁进行适当稀释，摇匀，用UV-2550型紫外可见分光光度计在400～800 nm波长内进行光谱扫描，确定酸石榴汁的紫外-可见吸收光谱曲线。

1.2.3 树脂类型的筛选 (1)5种树脂静态吸附率的比较。 称取3.0 g活化好的供试5种大孔树脂(抽干水分)，分别置于锥形瓶中，各加入10 mL酸石榴汁，保鲜膜封口，于恒温摇床(25 ℃、100 r/min)振荡吸附，分别在0，0.25，0.5，1，2，3，4，5 h取出过滤，在最大吸收波长516 nm处测定滤液吸光度A1[10]。计算吸附率：

吸附率=[(A0×V0-A1×V1)/A0×V0]×100%。

(1)

式中：A0为吸附前样液的吸光度；V0为吸附前样液的体积；A1为吸附过滤后样液的吸光度；V1为吸附过滤后样液的体积。

(2)5种树脂静态解吸率的比较。 准确称取3.0 g吸附有花青素的5种大孔树脂，分别放入锥形瓶中，加入体积分数60%的乙醇10 mL，于恒温摇床(25 ℃、100 r/min)中振荡解吸，分别在0，0.25，0.5，1，2，3，4，5 h取出过滤，在516 nm处测定滤液吸光度A2，按下式计算解吸率[10]：

解吸率=[(A2×V2)/(A0×V0-A1×V1)]×100%。

(2)

式中：A0为吸附前样液的吸光度；V0为吸附前样液的体积；A1为吸附过滤后样液的吸光度；V1为吸附过滤后样液的体积；A2为解吸液的吸光度；V2为解吸后滤液的体积。

1.2.4 静态吸附的影响因素分析 (1)花青素质量浓度对树脂吸附率的影响。 首先用pH示差法测定酸石榴汁中的花青素含量[14-15]，分别吸取花青素质量浓度为0.164 mg/mL的酸石榴汁2，4，6，8，10 mL，用10 mL容量瓶定容，将酸石榴原汁配制成花青素质量浓度分别为0.032 8，0.065 6，0.098 4，0.131 2，0.164 0 mg/mL梯度的溶液，在516 nm处测定各质量浓度梯度酸石榴汁的吸光度A0，于恒温摇床(25 ℃、100 r/min)中分别将各质量浓度梯度酸石榴汁与3.0 g AB-8树脂振荡5 h后取出过滤，然后在516 nm处测定吸附后各滤液吸光度A1，按(1)式计算吸附率。

(2)温度对树脂吸附率的影响。 准确称取3.0 g活化好的AB-8树脂(抽干水分)置于锥形瓶中，加入10 mL质量浓度为0.131 2 mg/mL的酸石榴汁，分别在温度20，25，30，35，40 ℃条件下恒温摇床(100 r/min)振荡5 h后取出，过滤，在516 nm处测定滤液吸光度A1，按(1)式计算吸附率。

(3)酸石榴汁pH对树脂吸附率的影响。 将7份18 mL质量浓度为0.131 2 mg/mL的酸石榴汁分别置于7只小锥形瓶中，调节pH至1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0,定容至20 mL，分别在516 nm处测定其吸光度A0；然后分别移取10 mL各样液并准确称取7份3.0 g活化好的AB-8树脂(抽干水分)置于7只锥形瓶中，用保鲜膜封口，于25 ℃下100 r/min振荡5 h取出过滤，在516 nm处测定各滤液的吸光度A1，按(1)式计算吸附率。

(4)解吸液乙醇体积分数对树脂解吸率的影响。 按上述静态吸附试验确定的最佳条件，即采用质量浓度为0.131 2 mg/mL的酸石榴汁(pH 2.5)在25 ℃下制备吸附试验样品，过滤后得到吸附有花青素的AB-8树脂，按每份3.0 g取7份分别放入锥形瓶中，依次加入体积分数30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇10 mL，于恒温摇床(25 ℃、100 r/min)中振荡5 h取出过滤，在516 nm处测定滤液吸光度A2，按(2)式计算解吸率。

(5)解吸液pH对树脂解吸率的影响。 制备吸附试验样品后，过滤得到吸附有花青素的AB-8树脂，取6份(每份3.0 g)置于小锥形瓶中。将体积分数70%的乙醇pH调至1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，取上述乙醇溶剂各10 mL分别加入锥形瓶中，于恒温摇床(25 ℃、100 r/min)中振荡5 h后取出过滤，在516 nm处测定滤液的吸光度A2，按(2)式计算解吸率。

1.2.5 动态吸附的影响因素分析 (1)吸附流速对吸附率的影响。 准确称取3.0 g活化好的AB-8树脂(抽干水分)，装入层析柱中(Φ 2.5 cm×30 cm)，分别控制不同的流速(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL/min)将10 mL质量浓度为0.131 2 mg/mL(pH 2.5)的酸石榴汁在25 ℃下过柱，待样品液全部过柱后，在516 nm处测定其吸光度，按(1)式计算吸附率。

(2)解吸液流速对解吸率的影响。 将吸附有花青素的AB-8树脂装入层析柱中(Φ 2.5 cm×30 cm)，分别控制不同的流速(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL/min)采用体积分数70%乙醇(pH 2.0)解吸，收集全部流出液，在516 nm处测定其吸光度，按(2)式计算解吸率。

1.2.6 数据的处理 采用EXCEL 2003对试验数据进行处理，数据用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 酸石榴汁花青素的紫外-可见吸收光谱

图1显示，酸石榴汁最大吸收峰出现在516 nm。据报道，花青素的最大吸收峰在500～520 nm[12-13]，因此酸石榴汁吸收峰符合花青素的吸收光谱特性。

图1 酸石榴汁的紫外-可见吸收光谱曲线

2.2 酸石榴汁花青素最佳吸附树脂的确定

5种树脂静态吸附动力学和静态解吸动力学曲线分别如图2、3所示。由图2可知，5种大孔树脂相比，NKA-9的吸附性能最差，AB-8、X-5对酸石榴汁花青素的吸附性能均较好，但达平衡吸附时，AB-8 的吸附性能优于X-5。

由图3可知，AB-8的解吸性能也优于其他4种树脂。因此确定AB-8 为本试验的最佳树脂。

图2 5种大孔树脂静态吸附动力学的比较

2.3 静态吸附的影响因素分析

2.3.1 花青素质量浓度对树脂吸附率的影响 由图4可知，当酸石榴汁中的花青素质量浓度为0.131 2 mg/mL时，树脂的吸附率最大，在小于此花青素质量浓度时，吸附率随花青素质量浓度增加而增大，随质量浓度继续加大，吸附率却有所下降，可能是由于花青素质量浓度越高，与花青素竞争吸附的多糖等成分也随之增加,从而影响了花青素类物质在树脂内部的扩散。因此，选择 0.131 2 mg/mL的酸石榴汁作为吸附液。

2.3.2 温度对树脂吸附率的影响 由图5可知，在30 ℃时AB-8树脂对酸石榴汁花青素的吸附率最大，当温度继续升高，吸附率逐渐下降。温度升高可以促进分子运动进而影响吸附率，但随着分子运动的加剧，吸附率又会有所下降。由于室温25 ℃下的吸附率与30 ℃时相差不大，综合考虑，选择室温25 ℃为最适的吸附温度。

图4 花青素质量浓度对AB-8树脂吸附率的影响

2.3.3 酸石榴汁pH对树脂吸附率的影响 由图6可知，当pH值从1.0上升到2.5时，AB-8树脂对酸石榴汁花青素的吸附率亦呈上升趋势，之后又随着pH值的继续升高而下降。这是因为花青素结构中吡喃杂环上的氧原子使其表现出某些碱性性质，而其既含有酚羟基同时又具有某些酸的性质，因此不同pH可使花青素的化学结构发生变化，从而影响其与大孔树脂的相互吸引能力。本试验确定酸石榴汁花青素吸附的最佳pH为2.5。

2.3.4 解吸液乙醇体积分数对树脂解吸率的影响 由图7可以看出，随着乙醇体积分数的增大，AB-8树脂对酸石榴汁花青素的解吸率也逐渐增大，当乙醇体积分数达到70%后，解吸率开始下降。乙醇体积分数过高或过低时解吸率均相对较低，这是由于低体积分数的乙醇极性较大，难以渗入树脂的空隙结构之中，表现出较差的解吸率；过高体积分数的乙醇对花青素的溶解性差，解吸效果也不佳。所以选择体积分数70%乙醇作为解吸液。

2.3.5 解吸液pH对树脂解吸率的影响 由图8可以看出，以体积分数70%乙醇作解吸液，当pH为1.0～2.0时，AB-8树脂对酸石榴汁花青素的解吸率随着洗脱剂pH值的升高而升高，于pH=2.0时达到最高；当pH>2.0时，解吸率开始下降。因此，解吸液选用体积分数70%酸化乙醇，pH=2.0最为理想。

图6 酸石榴汁pH对AB-8树脂吸附率的影响

图8 解吸液pH对AB-8树脂解吸率的影响

2.4 动态吸附的影响因素分析

2.4.1 吸附流速对吸附率的影响 由图9可知，吸附流速在0.5～1.5 mL/min时,较慢的吸附流速有利于AB-8树脂对花青素的吸附；而吸附流速大于1.5 mL/min时，由于树脂尚未及时吸附，花青素已随吸附液流出,因此吸附率反而下降。由此可见,以1.5 mL/min流速通过树脂柱, 吸附效果最好。

2.4.2 解吸液流速对解吸率的影响 从图10可以看出，随着解吸液流速的增加，AB-8树脂对酸石榴汁花青素的解吸率逐渐升高，当流速为2.0 mL/min时，解吸率达到最高；继续增加流速，解吸率开始下降。说明流速过快不利于花青素类物质的解吸，原因是流速过快时解吸液不能与被吸附的花青素充分作用而将其从树脂上解吸出来。因此解吸流速2.0 mL/min是最适于纯化和富集的流速。

图9 吸附流速对AB-8树脂动态吸附率的影响

3 讨论与结论

1)树脂类型对花青素吸附-解吸的影响较大，在AB-8、X-5、D101、D101A、NKA-9等5种大孔树脂中，弱极性的AB-8树脂对酸石榴汁花青素表现出最优的吸附-解吸性能，这可能是由于AB-8树脂结构符合酸石榴汁中花青素的结构特性。

2)pH值对酸石榴汁的吸附-解吸特性影响较大，这是由于不同pH值会使花青素化学结构发生变化，从而影响其与大孔树脂相互吸附-解吸的能力，pH为2.0～2.5 时，AB-8树脂对酸石榴汁花青素的静态吸附-解吸效果最佳，故石榴汁花青素的加工或使用应在酸性介质中进行。

3)花青素质量浓度、温度、流速等因素对酸石榴汁花青素的吸附-解吸都有一定程度的影响，但影响相对较树脂类型和pH小。在具体工业化操作过程中，需要综合考虑各种因素，力求使酸石榴汁花青素的提纯效率最高。

4)AB-8 树脂纯化酸石榴汁花青素的静态吸附-解吸的最优工艺条件为：室温25 ℃、pH 2.5、花青素质量浓度0.131 2 mg/mL，解吸液采用体积分数70%酸化乙醇(pH 2.0)；动态吸附-解吸的最适工艺条件为：吸附流速1.5 mL/min，解吸流速2.0 mL/min。

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