琼胶酶产生菌Stenotrophomonas sp.Z705的发酵条件优化

缪伏荣,董志岩,刘 景

(福建省农业科学院 畜牧兽医研究所，福建 福州 350013)

琼胶(琼脂)是存在于红藻细胞壁中的一类多糖，是自然界中存在的重要碳源之一，是我国产量最大的海洋三大多糖(褐藻胶、琼胶、卡拉胶)之一，广泛应用于食品、医药、生物技术等领域[1]。琼胶由中性的琼胶糖(agarose)和离子性的硫琼胶(agaropectin)组成，其中琼胶糖是由1,3连接的β-D-半乳吡喃糖和1,4连接的3,6-内醚-α-L-半乳吡喃糖残基反复交替连接的链状中性多糖[2]。琼胶黏度高、溶解度低，影响了其在各领域中的应用；但琼胶降解后可产生一定分子质量和聚合度的琼胶寡糖，这些寡糖具有良好的抗癌[3]、抗氧化[4]、抗病毒[5]、增强免疫[6]等药理作用和生物活性。但由于未能找到有效降解琼胶的途径[7]，因此长期以来琼胶未能得到很好的开发利用。利用琼胶酶降解琼胶生产琼胶寡糖，被认为是当今最理想的绿色环保生产技术。但由于琼胶酶来源少、活性低、价格昂贵，难以满足琼胶寡糖生产的需要，因此，筛选高产琼胶酶的菌株及研究其发酵产酶具有重要的实际意义。

目前,已见报道的产琼胶酶菌属有Pseudomonas[8]、Pseudoalteromonas[9]、Streptomyces[10]、Alteromonas[11]、Vibrio[12]和Cytophaga[13]等。本试验从腐烂的紫菜中分离到1株高产琼胶酶的菌株，并将其初步鉴定为寡养单胞菌属Stenotrophomonassp.Z705[14]， 目前国内外尚未见该菌属产琼胶酶的相关报道。本研究通过单因素试验和正交试验,对该菌株的发酵产酶条件和培养基组成进行优化,旨在为琼胶酶的深入研究以及琼胶低聚糖的开发应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌种来源 寡养单胞菌属Stenotrophomonassp.Z705，由福建省农业科学院畜牧兽医研究所动物营养室提供。

1.1.2 培养基及试剂 纯化培养基：牛肉膏5 g，酵母浸膏1.5 g，琼脂15 g，陈海水1 000 mL，pH 7.2；121 ℃灭菌30 min。

种子和发酵培养基：牛肉膏5 g，酵母浸膏1.5 g，琼脂3 g，陈海水1 000 mL，pH 7.2。

主要试剂有DNS试剂[15]、0.2 mol/L磷酸缓冲液[16]、琼脂粉、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏等。

1.1.3 主要仪器 主要仪器有DY-89Ⅱ电动玻璃匀浆机、LRH-250A生化培养箱、SW-CJ-1FD单人超净工作台、热电multican fc 酶标仪、TDL-5000B高速冷冻离心机、DY-ⅢS水质分析仪、FW-80高速万能粉碎机、LDZS-30KBS立式高压灭菌器、CRY-200恒温摇床等。

1.2 菌株的培养

1.2.1 纯化培养 将Stenotrophomonassp.Z705划菌斜面置于28 ℃培养箱内培养2 d，然后置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 种子培养 在250 mL三角瓶中装入25 mL种子培养基，121 ℃灭菌30 min后，取培养好的斜面挑取1环于种子培养基中，28 ℃、200 r/min摇床培养24 h。

1.2.3 发酵培养 在250 mL三角瓶中装入25 mL发酵培养基，121 ℃灭菌30 min后，按体积分数0.1%的接种量接入种子液，28 ℃、200 r/min摇床培养23 h。

1.3 琼胶酶活力的测定

发酵培养11 h开始每2 h对发酵液取样1次。发酵液经4 000 r/min离心5 min，其上清液即为粗酶液。根据Imoto等[17]的方法，通过DNS-还原糖法测定发酵液的酶活，用D-半乳糖绘制标准曲线[18]。取粗酶液1 mL加入磷酸缓冲液1 mL，再加入0.3 g/L的琼胶底物溶液1 mL，50 ℃水浴酶解30 min后再于沸水浴中灭活5 min，立即用冰水冷却至室温，然后加入1.5 mL的DNS试剂；在沸水浴中保温显色5 min后，于室温下定容至10 mL，20 ℃、2 000 r/min离心5 min得上清液，用酶标仪测其在520 nm波长处的吸光度；同时以灭活酶作对照。在上述反应条件下，以1 mL酶液1 min产生1 μg还原糖作为1个酶活(U)。

1.4 菌株产琼胶酶发酵条件的优化

在发酵培养基基础上，按表1中的设计方案对发酵条件进行单因素试验，分析不同因素对菌株发酵产琼胶酶活力的影响，其他培养条件和培养基相同，每组设置3个重复。

1.5 菌株产琼胶酶发酵培养基的优化

1.5.1 单因素试验 首先，在获得菌株产琼胶酶发酵最佳条件的基础上，分析不同氮源(牛肉膏、酵母浸膏、蛋白胨、NaNO3、(NH4)2SO4)和碳源(葡萄糖、D-半乳糖、琼胶、果糖、麦芽糖)对菌株发酵产琼胶酶活力的影响；在筛选到最佳氮源(牛肉膏、酵母浸膏)以及最佳碳源(琼胶)的基础上进行单因素试验，培养基中氮源和碳源添加水平见表1。

表1 Stenotrophomonas sp.Z705菌株产琼胶酶发酵条件和培养基组成优化的单因素试验

1.5.2 正交试验 在单因素试验基础上，选择最佳氮源(牛肉膏、酵母浸膏)以及最佳碳源(琼胶)等培养基组分，采用三因素三水平L9(33)的正交试验(表2)筛选最佳培养基组成。所有试验重复3次，分别平行取样。用SPSS 13.0进行数据分析。

表2 Stenotrophomonas sp.Z705菌株产琼胶酶发酵培养基组成优化的正交试验方案

2 结果与分析

2.1 菌株产琼胶酶发酵条件的优化

2.1.1 装液量和摇床转速对菌株发酵产酶的影响 在微生物发酵过程中，溶氧量对好氧细菌的生长和产酶具有十分重要的作用。减少装液量和增加摇床转速均可以达到增加溶氧量的目的，使菌株快速地利用营养物质，从而有利菌株产酶。但溶氧量必须适度，过量供给会造成酶活力的下降。由图1可以看出，在转速为200 r/min时，随着装液量的增加，琼胶酶活力随之升高，至装液量为25 mL时，琼胶酶活力最高(37.8 U/mL)；然后随着装液量的增加，琼胶酶活力逐渐降低。从图2可知，在装液量为25 mL时，随着摇床转速的提高，琼胶酶活力随之升高，当摇床转速为200 r/min时，琼胶酶活力达到最高(35.6 U/mL)；之后随着摇床转速的提高，琼胶酶活力逐渐降低。可知最佳装液量和摇床转速分别为25 mL和200 r/min。

2.1.2 发酵时间对菌株发酵产酶的影响 由图3可见，在装液量25 mL和摇床转速200 r/min的条件下，培养11 h时琼胶酶活力为5.6 U/mL；随着发酵时间的延长，琼胶酶活力逐渐提高，至23 h琼胶酶活力达到最高(45.2 U/mL)；之后随着发酵时间增加，琼胶酶活力逐渐下降。表明最佳发酵时间为23 h。

2.1.3 初始pH值对菌株发酵产酶的影响 海水的pH为7.2～8.3，海洋细菌最适宜生长的pH值与此关系密切。培养物的pH不仅直接影响菌体对营养物的吸收及代谢产物的分泌，而且影响营养物的分解。从图4可以看出，在培养基的初始pH值为6.4时，琼胶酶活力为0.6 U/mL，随着培养基初始pH值的升高，Stenotrophomonassp.Z705菌株产琼胶酶活力逐渐提高，当初始pH值为7.2时达到最高(46.3 U/mL)；之后随着培养基初始pH值的升高，琼胶酶活力逐渐下降。表明最佳初始pH值为7.2。

2.1.4 培养温度对菌株发酵产酶的影响 培养温度是影响微生物生长和代谢的最重要的环境因素之一。适当地提高培养温度有助于促进微生物的生长和酶促反应。从图5可以看出，在培养温度为20 ℃时，琼胶酶活力为17.53 U/mL，随着培养温度的升高，Stenotrophomonassp.Z705菌株产琼胶酶活力逐渐提高，当培养温度为28 ℃时，琼胶酶活力最高(43.8 U/mL)；之后随着培养温度升高，琼胶酶活力下降。可知最佳培养温度为28 ℃。

2.1.5 盐度对菌株发酵产酶的影响 盐度与海洋细菌的生长密切相关，是区分海洋菌与淡水菌的重要指标。本试验改变培养基的盐度，来研究该菌株产酶最适的盐度。从图6可以看出，随着发酵培养基盐度的升高，Stenotrophomonassp.Z705菌株产琼胶酶活力逐渐提高，至发酵盐度为3.4%时达最高(43.2 U/mL)；之后随着发酵液盐度的升高，琼胶酶活力逐渐下降。表明此菌株是典型的海洋细菌，具有耐高渗透压的特性，发酵培养的最佳盐度为3.4%。

图1 装液量对Stenotrophomonas sp.Z705菌株发酵产琼胶酶的影响

图3 发酵时间对Stenotrophomonas sp.Z705菌株产琼胶酶的影响

图5 培养温度对Stenotrophomonas sp.Z705菌株发酵产琼胶酶的影响

2.2 菌株产琼胶酶发酵培养基组成优化的单因素试验

2.2.1 氮源对菌株发酵产酶的影响 图7显示，以牛肉膏作为氮源时，Stenotrophomonassp.Z705菌株产琼胶酶活力最大，其次为酵母浸膏。因此，分别选用牛肉膏和酵母浸膏作为氮源，研究其对Stenotrophomonassp.Z705菌株产琼胶酶活力的影响。从图8可以看出，随着牛肉膏添加量的增加，琼胶酶活力逐渐提高，至牛肉膏添加量为5.0 g/L时，琼胶酶活力最高(45.6 U/mL)；之后随着牛肉膏添加量升高，琼胶酶活力下降。由图9可见，随着酵母浸膏添加量增加，琼胶酶活力逐渐提高，当酵母浸膏添加量为1.50 g/L时，琼胶酶活力最高(41.8 U/mL)；之后随着酵母浸膏添加量的增加，琼胶酶活力下降。

图7 不同氮源对Stenotrophomonas sp.Z705菌株发酵产琼胶酶的影响

图8 牛肉膏添加量对Stenotrophomonas sp.Z705菌株发酵产琼胶酶的影响

2.2.2 碳源对菌株发酵产酶的影响 碳源是微生物生长和发酵过程中必需的营养物。它不仅可为微生物生长繁殖提供能量，还可为菌体合成目标产物提供所需的碳成分。本研究中，不同碳源对Stenotrophomonassp.Z705菌株发酵产琼胶酶的影响见图10和图11。

图10 不同碳源对Stenotrophomonas sp.Z705菌株发酵产琼胶酶的影响

图10显示，以琼胶作为惟一碳源时，发酵液培养Stenotrophomonassp.Z705菌株产琼胶酶的活力最高。因此，选用琼胶作为碳源，研究其对Stenotrophomonassp.Z705菌株产琼胶酶活力的影响。从图11可以看出，随着琼胶添加量的升高，琼胶酶活力逐渐提高，琼胶添加量为0.30 g/L时琼胶酶活力达到最高(43.5 U/mL)；之后随着琼胶添加量的升高，琼胶酶活力逐渐降低。这可能是因为随着琼胶添加量的增加，培养基的流动性变差，发酵液通气量降低，从而影响了菌株的发酵产酶性能。

2.3 菌株产琼胶酶发酵培养基组成优化的正交试验

从单因素试验结果可以看出，Stenotrophomonassp.Z705菌株产琼胶酶的最佳发酵条件为：装液量25 mL、摇床转速200 r/min、发酵时间23 h、初始pH 7.2、发酵温度28 ℃、盐度3.4%；发酵培养基中的牛肉膏、酵母浸膏和琼胶对该菌株的产酶影响较大。从表3和表4可见，影响Stenotrophomonassp.Z705菌株产琼胶酶活力的因素顺序为A(牛肉膏)>B(酵母浸膏)>C(琼胶)；同时各因素对该菌产酶水平均有显著的影响(P<0.05)，确定Stenotrophomonassp.Z705菌株发酵的最佳培养基组成为A2B2C3，即牛肉膏5.0 g/L、酵母浸膏1.50 g/L、琼胶0.30 g/L。结合最佳发酵条件，经多次发酵试验，该菌株发酵产琼胶酶活力稳定在87.1 U/mL左右。

表3 Stenotrophomonas sp.Z705菌株产琼胶酶发酵培养基组成优化的正交试验结果

表4 Stenotrophomonas sp.Z705菌株产琼胶酶发酵培养基优化的正交试验结果的方差分析

3 讨 论

微生物发酵产酶是一个复杂的生理生化过程，菌体不同的营养条件会直接影响菌体的代谢，从而影响酶的产量。要提高酶的产量，就必须对发酵产酶的条件进行优化[19]。不同的琼胶酶产生菌的培养条件不相同，各种因素如培养基的组成、培养温度、初始pH值、培养时间等都对产酶有很大的影响。本研究以来源于腐烂紫菜且具有较高琼胶降解能力的野生菌株Stenotrophomonassp.Z705为出发菌株，以提高菌株的产酶活性为目的，对其产酶发酵条件和培养基组成进行了优化，确定Stenotrophomonassp.Z705菌株的最佳发酵条件为：装液量25 mL、摇床转速200 r/min、发酵时间23 h、初始pH 7.2、发酵温度28 ℃、盐度3.4%；最佳培养基组成为：牛肉膏5.0 g/L、酵母浸膏1.50 g/L、琼胶0.30 g/L，在此条件下该菌株产酶效果最好，琼胶酶活力最高。经多次发酵试验，该菌株发酵产琼胶酶活力稳定在87.1 U/mL左右，与优化前(平均酶活力为34.49 U/mL)相比提高了60.4%。

与国内外已报道的琼胶酶产生菌相比，首先从酶活力方面而言，菌株NBRC102603[20]为56.89 U/mL，菌株HF3-04[21]为80.7 U/mL，Bacillussp.MK03[22]为14.1 U/mL，Vibriosp.JT0107[23]为66 U/mL，AgarivoransalbusYKW-34[24]为83 U/mL，均低于本研究中的Stenotrophomonassp.Z705菌株；其次从琼胶酶活力达到最高时的发酵时间而言，MA-B22[25]需要60 h，Halomonassp.DT-3[26]需要36 h，而本研究供试菌株仅需23 h。目前我国尚未有工业化产琼胶酶的菌株，所需产品均来自国外，价格昂贵，而本研究供试菌株发酵培养基组分简单低价、培养条件简便，稳定性好，具有一定的生产潜力，可为琼胶酶的深入研究及琼胶低聚糖的开发应用奠定基础。

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