石油污染胁迫下植株根区土壤微生物多样性分析

王晨霞，来航线，韩 刚，李凯荣，韦小敏

(西北农林科技大学 a 资源环境学院,b 林学院,陕西 杨凌 712100)

近年来，随着石油勘探开发和区域经济的不断发展，受石油污染的土壤面积不断扩大，污染程度也日益增加[1]。有数据显示，全世界每年约有800万t石油进入环境，我国每年有近60万t石油进入环境形成污染[2]。在辽河油田、胜利油田和冀东油田等新老重污染区，土壤中的原油含量已经达到或超过1.0×104mg/kg，甚至达1.0×105mg/kg[3]。由于石油中含有多种复杂的芳香烃，这些物质毒性大，并且进入土壤后难以去除，从而引起严重的环境问题[4-5]，因此石油污染土壤的修复已引起人们的高度关注。目前，国内外研究人员对石油污染土壤的生物修复进行了大量研究，业已筛选了许多石油降解菌，但对于石油污染胁迫下土壤微生物的群落组成和动态变化了解甚少[6-7]。Sanjeet等[8]研究表明，石油污染物的降解是微生物群落共同作用的结果。因此，研究石油污染胁迫对土壤微生物多样性的影响至关重要。

用于测定土壤微生物多样性的方法很多，传统的研究方法主要包括微生物平板培养法、电镜法、染色法等[9]。随着分子生物学的发展，PLFA、Biolog微平板法、RFLP、T-RFLP等技术受到越来越多的关注[10]。目前，这些方法在石油污染土壤微生物多样性的研究中均有所应用。不可否认的是，传统的微生物平板培养计数法仍是一个评价污染胁迫效应的有效方法[11-12]，但这种方法过于粗放，因此只有将传统平板培养法与现代生物技术结合，才能更加客观全面地反映微生物群落结构的真实信息。Biolog微平板法是通过微生物对多种碳源底物的利用能力来反映微生物群落的功能多样性，可比较全面地表征土壤微生物群落结构、总体代谢活性与功能信息，是目前已知的研究微生物代谢功能多样性的有力方法[13-14]。

本研究将微生物平板培养法与Biolog微平板法相结合，辅以土壤微生物呼吸强度的测定，从多个角度探讨石油污染胁迫下刺槐、油松、紫穗槐和沙棘4种耐性植株根区的土壤微生物多样性，旨在了解石油污染胁迫土壤生物降解过程中起重要作用的微生物类群，以及从微生物角度为石油污染土壤生物修复时的植株选择、评价等提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试土壤 供试土壤 (黄绵土) 来自陕北安塞县人为活动稀少的无污染荒草地，采样深度0～20 cm。

1.1.2 供试原油 采自陕北安塞县化子坪油区井口。

1.1.3 供试植株 依据陕西延安气候和土壤条件，选取刺槐、油松、紫穗槐和沙棘4种耐性植株。

1.1.4 供试培养基 参照《微生物学实验技术》，放线菌分离用高氏一号培养基，细菌分离用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，真菌分离用PDA培养基[15]。

1.2 供试土壤预处理

采用常规分析方法[16]，测定供试土壤的全氮、硝态氮、铵态氮、速效磷、速效钾、pH值和有机质等基本理化性质，测定结果见表1。

供试土壤去掉植物残体和其他杂质，风干并过4 mm筛，测定土壤含水量后，装入31 cm×23 cm×27 cm (上口直径×底部直径×高) 的塑料桶中，每桶装土12.94 kg (以土壤干质量计)，按设计的石油污染胁迫水平采用完全混合的方式分别添加供试原油，使盆栽土壤的石油污染胁迫水平为0，5，10，15和20 g/kg。供试土壤与供试原油混合时不使用任何有机溶剂，混匀后静置15 d。

表1 供试安塞黄绵土的理化性质

于2012年3月初，选取苗高、地径相对一致，根系完整的供试植株幼苗统一截干后，植入前期所制备的不同石油污染胁迫水平的盆栽土壤中。每盆重复栽植3株供试植株幼苗，每种供试植株对各石油污染胁迫水平的处理设置6个重复，同时设置无盆栽植株的空白对照 (CK)。为防止天然降水，定植后将盆栽放置于可移动式防雨棚内，晴天正常光照并充分供水，保证各处理幼苗成活和正常生长。试验中各盆栽土壤的水分含量控制在初始土壤田间持水量的75%。

1.3 试验土样的采集与处理

2012年8月末以混合采样法采取试验盆栽植株根区的土壤。所采集土样去除根系和其他杂质后装于自封袋内并编号，4 ℃低温保存，用于后续试验分析。

1.4 试验方法

1.4.1 土壤微生物区系分析 试验土样用牛肉膏蛋白胨琼脂、PDA及高氏一号培养基按梯度稀释法培养，其中PDA培养基加体积分数 0.3% 乳酸调pH，高氏一号培养基加入80 mg/L K2Cr2O4抑制剂。培养周期结束后以四分法按每克干土质量菌落数(CFU/g) 计数。之后依据菌落培养特征观察记录不同微生物种类，并对培养特征相似的细菌进行革兰氏染色镜检观察，初步确定细菌种类。

1.4.2 土壤微生物群落呼吸强度的测定[17-18]微生物呼吸强度的测定采用酸碱滴定法。试验中以每消耗1 mL 0.1 mol/L NaOH 相当于2.2 mg CO2量为标准，计算各处理土壤呼吸作用的CO2释放量，以土壤呼吸释放CO2的毫克数 (CO2mg/g干土) 表征微生物群落的呼吸强度。

1.4.3 土壤微生物功能多样性分析[19-20]将试验土样制备为土壤悬液，活化后按梯度稀释法稀释至10-3，接种于ECO生态测试板上。将接种好的测试板加盖，于(25±1) ℃培养240 h，其间每隔24 h用Biolog自动读数装置于590 nm波长下读取吸光度值。

(1) 土壤微生物对碳源利用的整体特征。采用ECO生态测试板上每孔颜色平均变化率，即590 nm波长下土壤微生物群落的平均吸光度值 (Average well-color development，AWCD) 来描述微生物对碳源利用的整体情况及利用活性。

(2) 土壤微生物多样性指数(H′)。以ECO生态测试板培养96 h后测定的吸光度值为基础，计算Shannon指数H′[21]来反映微生物群落代谢功能的多样性。AWCD、Shannon指数H′按下式计算：

AWCD=∑(Ci-C0)/n，H′=-∑pilnpi。

式中：Ci为每个孔的吸光度值，C0为对照孔的吸光度值，n为碳源孔数；pi为第i孔相对吸光度值与整个平板相对吸光度值总和的比值[22]。

(3) 土壤微生物对6大类型碳源的利用特征。将ECO生态测试板上的31种碳源分成6大类型，分别为羧酸类7种、碳水化合物类10种、氨基酸类6种、多聚物类4种、胺类2种和酚酸类2种。土样中微生物群落对6大类型碳源的利用特征以相对吸光度值ΔC(ΔC=C-C0，其中C表示各碳源类型吸光度值的平均值)来表征。

(4) 主成分分析。通过主成分分析 (Principal component analysis,PCA) 将ECO生态测试板中的31种碳源形成的描述群落代谢特征的多元向量变换为互不相关的主元向量 (PC1和PC2)，在降维后的主元向量空间中用点的位置直观地反映不同微生物群落的代谢特征。

1.4.4 数据处理与分析 试验数据通过Excel及SPSS18.0软件进行统计与分析。

2 结果与分析

2.1 土壤微生物区系分析

土壤中可培养微生物 (细菌、真菌、放线菌) 的种类和数量是衡量土壤微生物区系状况的重要指标[23]。本试验使用3种固体培养基，用稀释平板涂布法对土样中可培养的微生物进行分离计数，以此表征可培养微生物群落组成的多样性，结果见表2。

表2 不同石油污染胁迫水平下4种植株根区土壤中可培养微生物的种类及数量

由表2可以看出，在无石油污染胁迫时，栽有植株的根区土样中，可培养微生物的种类与数量总和均高于无植株土样，说明所栽植的4种植株均能够增加土壤微生物多样性；当石油污染胁迫水平逐渐提高时，不同植株根区土壤微生物多样性的变化不同，说明4种植株对石油污染胁迫的抗性存在差异。如当石油污染胁迫水平为10 g/kg时，各植株根区土样可培养微生物种类的多少排序为：刺槐>油松>沙棘>紫穗槐。总体来看，在石油污染胁迫水平提高时，刺槐植株对根区土壤中微生物多样性的促进作用最强。

进一步分析表2数据发现，当石油污染胁迫水平在5～10 g/kg时，油松、沙棘、刺槐植株根区土壤微生物种类随污染水平的提高而增加；当石油污染胁迫水平高于10 g/kg时，油松、沙棘、刺槐植株根区土壤微生物种类随石油污染胁迫水平的提高而减少；说明5～10 g/kg石油污染胁迫水平能有效刺激油松、沙棘、刺槐植株根区土壤微生物的生长，但高水平石油污染胁迫会对部分土壤微生物产生毒害作用，抑制其生长，使得油松、沙棘、刺槐植株根区土壤微生物的种类减少。此外，由表2还可以看出，紫穗槐植株根区土壤微生物的种类在不同石油污染胁迫水平下的变化无规律性。

2.2 土壤微生物呼吸强度分析

土壤微生物呼吸作用是土壤微生物生命活动中释放CO2的过程，其强弱变化是反映微生物活性及土壤生化强度的总指标[24-25]。本试验采用酸碱滴定法对石油污染胁迫下不同植株根区土壤样品的呼吸强度进行了测定，结果见图1。由图1可以看出，在无石油污染胁迫时，油松植株根区土壤微生物呼吸强度低于无植株对照土壤；当石油污染胁迫水平递增到15 g/kg时，栽有植株的根区土壤微生物呼吸强度均略高于无植株对照土壤；当石油污染胁迫水平为20 g/kg时，栽有植株的根区土壤微生物呼吸强度明显高于无植株对照土壤。说明试验所栽植的4种植株对根区土壤微生物生长有刺激作用，且这种刺激作用在高水平石油污染胁迫下表现得更为明显，这与区系分析中所得到的“试验植株能够增加石油污染胁迫下土壤微生物多样性”的结论相一致。

图1 不同石油污染胁迫水平对4种植株根区土壤微生物呼吸强度的影响

进一步分析发现，不同水平石油污染胁迫对各处理土壤微生物呼吸强度的作用不同。其中，无植株土壤微生物呼吸强度在0～5 g/kg石油污染胁迫水平内上升，其后逐渐减弱；油松与沙棘植株根区土壤微生物呼吸强度随石油污染胁迫水平的增加表现出相似的变化趋势：在0～10 g/kg石油污染胁迫水平，植株根区土壤微生物呼吸强度出现轻微波动，高于10 g/kg石油污染胁迫水平后逐渐上升，在15 g/kg 石油污染胁迫水平下达到最大值，其后随石油污染胁迫水平的升高而下降；刺槐根区土壤微生物呼吸强度在0～10 g/kg石油污染胁迫水平逐渐下降，在10～20 g/kg石油污染胁迫水平逐渐增加；紫穗槐根区土壤微生物呼吸强度随石油污染胁迫水平升高而增加，至10 g/kg石油污染胁迫水平时达到最大值，其后随石油污染胁迫水平升高而降低(图1)。

2.3 土壤微生物功能多样性分析

2.3.1 土壤微生物对碳源利用的整体特征AWCD可以从功能代谢水平上揭示微生物群落结构的多样性，是反映土壤微生物群落对碳源利用整体情况及利用活性的重要指标[26]。本研究用各植株根区土壤微生物平均吸光度值 (AWCD) 随培养时间变化的趋势，来表征不同石油污染胁迫水平下土壤微生物群落结构的多样性，各植株根区土壤微生物群落培养过程中AWCD在不同石油污染胁迫水平下的变化趋势见图2～7。

图2 无石油污染胁迫条件下不同植株根区土壤微生物群落培养过程中AWCD的变化

图4 不同石油污染胁迫水平下油松根区土壤微生物群落培养过程中AWCD的变化

图6 不同石油污染胁迫水平下沙棘根区土壤微生物群落培养过程中AWCD的变化

图2为无石油污染胁迫条件下不同植株根区土壤微生物群落培育过程中AWCD的变化趋势。由图2可知，在无石油污染胁迫条件下，油松植株根区的AWCD明显低于无植株的对照；沙棘植株根区的AWCD接近无植株的对照；刺槐与紫穗槐植株根区的AWCD均高于无植株的对照，说明刺槐与紫穗槐植株在一定程度上促进了根区土壤微生物对碳源的利用。

由图3～7可以看出，不同石油污染胁迫水平下各处理的AWCD随培养时间不断增加；在不同石油污染胁迫水平下，各植株根区土壤微生物碳源利用的整体情况存在差异。总体上，各植株根区土壤微生物在5～10 g/kg石油污染胁迫水平下对碳源的利用能力较强，20 g/kg石油污染胁迫水平下碳源利用的能力较弱。结合微生物区系及呼吸强度的结果，推测造成这一现象的原因可能是，5～10 g/kg的石油污染胁迫为微生物生长提供了更多的碳源物质，从而刺激了微生物生长，但高水平的石油污染胁迫对微生物产生了一定程度的毒害作用，使微生物利用碳源的能力有所减弱。

2.3.2 微生物多样性指数(H′) 的比较 多样性指数可表征不同土壤微生物群落利用碳源类型的多少，即功能多样性[27]。在不同石油污染胁迫水平下，各植株根区土壤微生物培养96 h时对碳源利用的H′见表3。由表3可以看出，在不同石油污染胁迫水平下，栽有植株的根区土壤微生物H′除油松、沙棘在10～15 g/kg石油污染胁迫水平时略低于无植株的对照外，在其余条件下均高于无植株对照。表明试验中所栽植株均能够有效提高根区土壤微生物的多样性，在石油污染胁迫下，其对根区土壤微生物的多样性具有保护作用。

表 3 不同石油污染胁迫水平下4种植株根区土壤微生物对碳源利用的H′

2.3.3 刺槐根区土壤微生物对6大类型碳源的利用特征AWCD值与H′在总体上反映了土壤中微生物群落的变化情况，但不能阐释土壤中微生物群落碳源代谢的微观信息。本研究进一步对土壤中微生物群落利用的碳源进行分类，并以相对吸光度值ΔC分析不同处理土样中微生物群落对6大类型碳源的利用情况，以此反映土壤微生物的代谢功能[28]。由于ECO生态测试板培养96 h时，微生物对碳源的利用 (即ΔC) 的变化趋于稳定，因此对碳源利用特征的描述选取96 h的ΔC进行表征[29]。由于在同一石油污染胁迫水平下，刺槐植株根区土壤微生物较其他3种植株既表现出代表性的变化趋势，又具有更高活力，所以以刺槐植株根区土壤微生物的碳源利用特征为例进行分析，结果见图8。

图8 不同石油污染胁迫水平下刺槐根区土壤微生物对6类碳源的利用情况

由图8可以看出，随石油污染胁迫水平的提高，刺槐根区土壤微生物对碳水化合物类群的利用率逐渐降低，表明石油污染胁迫对根区土壤微生物利用碳水化合物类碳源产生了抑制作用；刺槐根区土壤微生物对多聚物类及胺类的利用趋势类似，均先随石油污染胁迫水平增加而提高，在10 g/kg石油污染胁迫水平时ΔC达到最大值，其后随石油污染胁迫水平的增加利用率有所降低，表明一定水平的石油污染胁迫刺激了根区土壤中多聚物类群及胺类群微生物的生长，但过高水平的石油污染胁迫则会产生抑制作用；刺槐根区土壤微生物对羧酸类与酚酸类碳源利用的ΔC在5 g/kg石油污染胁迫水平时最大，20 g/kg石油污染胁迫水平时最小，酚酸类群此时的ΔC甚至为0，表明20 g/kg高石油污染胁迫水平对根区土壤中羧酸类群与酚酸类群微生物的生长产生了极强的抑制作用。总体上，一定水平的石油污染胁迫能够促进根区土壤微生物对碳源的利用，但15～20 g/kg石油污染胁迫水平会对根区土壤微生物利用碳源产生抑制作用，其中20 g/kg石油污染胁迫水平对微生物类群产生的毒害作用最大，推测20 g/kg石油污染胁迫水平可能已经达到部分根区土壤微生物耐受的上限。

进一步分析发现，在同一石油污染胁迫水平下，刺槐根区土壤微生物利用不同碳源的程度有明显差异：无石油污染胁迫条件下的优势群落结构为碳水化合物类群>多聚物类群>氨基酸类群；5 g/kg石油污染胁迫水平下的优势群落结构为碳水化合物类群>多聚物类群>酚酸类群；10 g/kg石油污染胁迫水平下的优势群落结构为多聚物类群>碳水化合物类群>胺类群；15～20 g/kg 石油污染胁迫水平下的优势群落结构为碳水化合物类群>多聚物类群>氨基酸类群(图8)。由此可以看出，在同一石油污染胁迫水平下，刺槐植株根区土壤微生物偏向利用碳水化合物类和多聚物类碳源，推测该部分碳源可能是某些根区土壤微生物生长的必需物质。

2.3.4 土壤微生物功能多样性的主成分分析 Biolog ECO生态测试板共有31种不同的碳源，即31个变量。如果评估微生物功能多样性变化的过程中考虑全部变量，往往会使分析过程更为复杂，因此利用主成分分析法，通过对变量的分析整合，将其合并为若干个综合变量，这些综合变量具有较高的方差贡献率，提取综合变量中的若干个主成分就可以对整个样本进行分析，以此达到降维并降低评估复杂性的目的[30]。本研究选取刺槐根区土壤微生物培养96 h后测得的吸光度值进行主成分分析，以贡献率最高的主成分 (PC1和PC2) 在空间中的位置，描述不同石油污染胁迫水平下根区土壤微生物功能多样性的差异，结果见图9。

图9 不同石油污染胁迫水平下刺槐根区土壤微生物功能多样性的主成分分析

在PCA中，31个主成分因子中前13个因子的累计方差贡献率达99.505%，从中提取可以聚集单一碳源变量数据变异的前2个主成分PC1和PC2，其累计方差贡献率分别为33.70%，21.68%，因此认为这2个主成分可以表征不同石油污染胁迫水平下刺槐根区土壤微生物群落代谢能力的基本轮廓。由图9可见，不同石油污染胁迫水平下的刺槐根区土壤微生物功能多样性在主成分坐标体系中分布差异明显。PC1的方差贡献率最大，可将10 g/kg石油污染胁迫水平与0，20 g/kg石油污染胁迫水平明显区分；其中，10 g/kg石油污染胁迫水平处于PC1的正端，在PC1轴上值达1.64。PC2可将0 g/kg石油污染胁迫水平与其他石油污染胁迫水平区分；其中，仅0 g/kg石油污染胁迫水平处于PC2正轴方向，在PC2轴上的值为1.74。

单一碳源在主成分PC1和PC2上的载荷因子，反映了主成分与该单一碳源利用的相关系数，载荷因子越大，表示该单一碳源对主成分的影响越大。表4显示了不同石油污染胁迫水平下刺槐植株根区土壤微生物对31种碳源的利用情况在PC1及PC2上的载荷因子。由表4可知，单一碳源对PC1贡献最大的6种碳源分别为2类氨基酸 (L-苯丙氨酸、L-丝氨酸)、3类多聚物 (吐温40、吐温80、肝糖)、1类羧酸 (D-半乳糖醛酸)，可见影响PC1的碳源主要为多聚物类和氨基酸类；单一碳源对PC2贡献最大的6种碳源包含4类碳水化合物 (N-乙酰-D-葡萄糖胺、β-甲基-D-葡萄糖苷、α-D-乳糖、D-纤维二糖)、1类氨基酸 (L-精氨酸)、1类羧酸 (衣康酸)，可见影响PC2的碳源主要为碳水化合物类。

表4 刺槐植株根区土壤微生物对31种碳源利用情况的主成分载荷因子

3 讨 论

本研究结果显示，5～10 g/kg石油污染胁迫水平增加了土壤微生物的种类，且在该石油污染胁迫水平下土壤微生物对碳源的利用能力较强。岳冰冰等[31]的Biolog微平板分析结果显示，石油污染明显提高了土壤微生物群落的代谢活性，马会强等[13]的研究也有类似的结果。李慧等[32]的研究认为，石油污染可显著提高土壤微生物 (细菌、放线菌、真菌) 的数量。本试验再次证实，一定水平的石油污染胁迫对土壤微生物多样性具有促进作用。同时，本试验发现，10 g/kg以上石油污染胁迫水平，对各植株根区土壤微生物的碳源利用具有抑制作用。原因可能是，高水平石油污染胁迫自身的毒害作用及其对原本适合大部分微生物生长的土壤理化条件的改变作用，使大部分微生物生长受到抑制，植株根区土壤中的大部分微生物难以适应这种高水平的石油污染胁迫。

本研究发现，栽有植株的根区土壤微生物多样性及碳源利用能力整体高于无植株对照土壤，说明4种供试植株对土壤微生物多样性具有一定的保护作用，这种保护作用在高水平石油污染胁迫下表现更为明显，这一结论对环境保护及污染环境的修复具有重要的指导意义。推测供试植株对土壤微生物多样性形成保护作用的原因可能为，植株根系降解了部分石油污染物质，减弱了石油污染对土壤中微生物的胁迫作用，维护了微生物的生长环境。本研究还发现，4种供试植株根区土壤微生物对石油污染胁迫具有不同的响应；其中，栽植刺槐的植株根区土壤微生物多样性最为丰富，因此认为刺槐植株在石油污染土壤修复中占有优势。

4 结 论

4种供试植株均能提高石油污染胁迫下根区土壤微生物的多样性，其中刺槐植株对根区土壤微生物多样性的保护作用最强。因此从微生物角度来看，在石油污染土壤生物修复中选择栽植刺槐植株将会具有较为理想的效果；5～10 g/kg石油污染胁迫水平能促进土壤微生物对碳源的利用，增加土壤微生物的种类，15～20 g/kg石油污染胁迫水平降低了土壤微生物的多样性，对微生物生长产生毒害作用。

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