二次通用旋转组合设计优化紫菜粗多糖的提取

郭 萌，谢三都，叶丽淑



二次通用旋转组合设计优化紫菜粗多糖的提取

郭 萌1，谢三都2，叶丽淑2

(1.漳州职业技术学院 食品与生物工程系，福建 漳州 363000;2.福建师范大学闽南科技学院 生命科学与化学系，福建 泉州 362332)

采用复合酶法，在单因素基础上，通过二次通用旋转组合设计优化紫菜粗多糖（Crude Polysaccharide from，CPP）提取工艺条件。结果表明，紫菜粗多糖的最佳提取工艺条件为：料液比（mg/mL）1︰40、pH4.0，添加含5%纤维素酶和5%果胶酶的复合酶，65℃恒温酶解150min（纤维素酶30min、果胶酶120min），所得紫菜粗多糖提取率为4.78%。

紫菜；粗多糖；纤维素酶；果胶酶；二次通用旋转组合设计

紫菜（）属红藻类、紫菜属，素有“岩礁娇子”之称[1]。现代营养学研究发现，干紫菜中含蛋白质、碳水化合物、维生素等大量的营养物质[2][3]，具有极高的营养保健价值。目前，我国紫菜加工总体水平低下，紫菜制品主要有紫菜饼、紫菜片等粗加工紫菜食品[4]，产品的附加值较低。

多糖广泛存在于动物细胞膜、植物和微生物细胞壁中，是一类有醛糖和（或）酮糖通过糖苷键连接而成的天然大分子。紫菜多糖（Polysaccharide from，PP）属半乳聚糖硫酸酯，主要由半乳糖、3，6-内醚半乳糖和硫酸基等组成，占紫菜干质量的20％-40％，是紫菜的主要成分之一[5]。现代医学研究发现，紫菜多糖具有抗凝血等多重生物学活性[6-8]。从紫菜中提取紫菜多糖成为开拓紫菜精深加工的新的途径之一。

本文以紫菜粗多糖提取率为指标，采用苯酚-硫酸法测定，在单因素实验基础上，采用二次通用旋转组合设计优化了纤维素酶复合果胶酶提取紫菜粗多糖的提取工艺条件，为紫菜多糖的工业化应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

原料：紫菜，购于超市。

试剂：纤维素酶：2000U/g、果胶酶：30000U/g，均由广西南宁庞博生物工程有限公司提供；D-葡萄糖，苯酚，浓硫酸，碳酸钠，以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JSP-100型高速多功能粉碎机：浙江省金德机械制造厂；雷磁pHS-3C pH计：上海精密科学仪器有限公司；HH-8型数显恒温水浴锅：江苏省荣华仪器制造有限公司；台式离心机TDL-40B：上海安亭科学仪器厂；UV755B型紫外可见分光光度计：上海佑科仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1紫菜粗多糖提取工艺流程

紫菜→烘干→粉碎→40目过筛→复合酶提取→灭酶（90℃，15min）→粗虑→离心分离（4000r/min，10min）→干燥→紫菜粗多糖。

1.3.2紫菜粗多糖含量的测定

1.3.2.1标准曲线的绘制

参照谢三都[9]等关于植物多糖的测定方法，以葡萄糖为标准样，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，所得标准曲线如图1所示，所得标准曲线方程为：Y=0.0022X+0.0232，R2=0.9993，其中，X表示葡萄糖溶液浓度，单位μg/mL，Y表示吸光度OD490nm，该方程表明在0-40μg/mL范围内，葡萄糖溶液浓度与吸光度呈良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线

1.3.3.2紫菜粗多糖含量的测定

准确称取2.5g紫菜粉，复合酶提取获得紫菜粗多糖溶液，按1.3.2.1方法中葡萄糖标准溶液配制中的步骤操作，以试剂空白做参照，测定其吸光度。用标准曲线计算紫菜粗多糖提取率。

式中，X为样液的浓度（µg/mL），V为样液体积（mL），M为紫菜质量（µg）。

1.3.3单因素实验

1.3.3.1 不同料液比对紫菜粗多糖提取率的影响

将紫菜粉末按1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60的料液比配制，先分别加入3%纤维素酶50℃恒温酶解15min，再分别加入4%果胶酶50℃恒温酶解2h后，过滤、离心分离，测定滤液中紫菜多糖含量，研究不同料液比对紫菜粗多糖提取率的影响。

1.3.3.2不同pH对紫菜粗多糖提取率的影响

将紫菜粉末按1:40的料液比配制，调整pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，加入3%纤维素酶50℃恒温酶解15min，再加入4%果胶酶50℃恒温酶解2h后，过滤、离心分离，测定滤液中紫菜多糖含量，研究不同pH对紫菜粗多糖提取率的影响。

1.3.3.3时间对紫菜粗多糖提取率的影响

将紫菜粉末按1:40的料液比配制，调整pH5.0，先加入3%纤维素酶50℃恒温酶解10、15、20、25、30min，再加入4%果胶酶50℃恒温酶解60、75、90、105、120min后，过滤、离心分离，测定滤液中紫菜多糖含量，研究不同时间对紫菜粗多糖提取率的影响。

1.3.3.4温度对紫菜粗多糖提取率的影响

将紫菜粉末按1:40的料液比配制，调整pH5.0，加入3%纤维素酶于45、50、55、60、65℃恒温酶解15min，再加入4%果胶酶于相同温度条件下恒温酶解2h后，过滤、离心分离，测定滤液中紫菜多糖含量，研究不同温度对紫菜粗多糖提取率的影响。

1.3.3.5复合酶添加量对紫菜粗多糖提取率的影响

将紫菜粉末按1:40的料液比配制，调整pH5.0，分别加入1、2、3、4、5%纤维素酶于50℃恒温酶解15min，再加入相同质量的果胶酶50℃恒温酶解2h后，过滤、离心分离，测定滤液中紫菜多糖含量，研究不同复合酶添加量对紫菜粗多糖提取率的影响。

1.3.4二次通用旋转组合试验设计

在单因素实验的基础上，分别将pH值、时间、温度、酶添加量对紫菜粗多糖提取率的影响，采用DPS数据处理系统设计四因素五水平二次通用旋转组合试验设计，如表1所示，试验结果分析均在DPS数据处理软件下运行。

表1 因素水平编码表

1.4 数据处理

应用DPS数据处理软件，对二次通用旋转组合设计试验结果的数据进行处理与分析。

2 结果与分析

2.1 不同料液比对紫菜粗多糖提取率的影响

图2 不同料液比对紫菜粗多糖提取率的影响

如图2所示，随着料液比的增加，紫菜粗多糖提取率逐渐增大；当料液比增加至1:40时，紫菜粗多糖提取率为1.426%；继续增加料液比，紫菜粗多糖提取略有下降。因此，料液比选1:40为宜。

2.2 不同pH对紫菜粗多糖提取率的影响

图3 不同pH对紫菜粗多糖提取率的影响

pH是酶促反应的主要条件之一。由图3可知，在pH值为4.5时，紫菜粗多糖提取率达到最大值。本反应体系下，复合酶水解的适宜pH为4.5。

2.3 不同提取时间对紫菜粗多糖提取率的影响

图4 不同提取时间对紫菜粗多糖提取率的影响

酶促反应随时间延长，酶解的效果增加。由图4可知，复合酶反应的最佳时间是纤维素酶水解20min，果胶酶水解90min，在此反应时间下，紫菜粗多糖提取率达到1.81%。

2.4 不同提取温度对紫菜粗多糖提取率的影响

图5 提取温度对紫菜粗多糖提取率的影响

温度是影响酶促反应速度的最主要因素之一。在适宜温度条件下，酶促反应速度达到最大值，此时酶解的效果最佳。由图5可知，复合酶反应的最适温度是55℃，此反应温度下，酶解速率最大，紫菜粗多糖提取率最高为2.1%。

2.5 复合酶添加量对紫菜粗多糖提取率的影响

图6 复合酶添加量对紫菜粗多糖提取率的影响

由图6可知，复合酶添加量为2%-8%时，随着酶添加量的增加紫菜粗多糖提取率显著增加；当酶添加量为8%时，紫菜粗多糖提取率达到最大；当酶添加量超过8%时对紫菜粗多糖提取率影响很小。因此，8%为酶解的最佳酶添加量。

2.6 二次通用旋转组合设计结果

2.6.1数学模型的建立与检验

二次通用旋转试验方案及试验结果见表2。

表2 二次通用旋转组合试验设计及结果

利用DPS软件对试验结果进行分析，得到二次回归模型为：

Y=1.9-0.1475X1-0.07417X2-0.02333X3+0.285X4-0.06104X12-0.16229X22+0.00146X32-0.09229X42-0.0375X1X2-0.265X1X3+0.18875X1X4+0.42125X2X3-0.005X2X4+0.1675X3X4

根据试验结果进行方差分析，结果见表3。

表3 试验结果方差分析表

从表3知，失拟F1=1.794＜F0.05（10，6）=4.06，P=0.14331＞0.05，拟合不足是不显著的；回归F2=3.840＞F0.01（14，16）=3.45，P=0.00763，回归呈极显著，因此说明该模型拟合度较好。对模型中各项系数进行检验，在α=0.01显著水平剔除不显著项后，简化后的回归方程为：

Y=1.9-0.1475X1+0.285X4-0.16229X22-0.265X1X3+0.18875X1X4+0.42125X2X3+0.1675X3X4。

最高值的各个因素组合：X1=－2、X2 =2、X3=2、X4=2，此时Ymax=4.78%。

即最优工艺条件是：复合酶水解pH值4.0，水解时间150min（其中纤维素酶水解时间30min、果胶酶水解时间120min），水解温度65℃，复合酶添加量10%。

2.6.2数学模型的应用分析

2.6.2.1单因子效应分析

将四因素中的三个固定在零水平，对数学模型进行降维分析，得到以其中一个因素为决策变量的偏回归模型，如图7所示。

图7 各试验水平对紫菜粗多糖提取率的影响

由图7可知，pH值4.0-6.0，时间70-120min，温度45-65℃，X4（复合酶添加量）对紫菜粗多糖提取率的影响最大，其次分别是X3（温度）、X1（pH）、X2（时间），各因素的变化趋势与所做的单因素分析相一致。

2.6.2.2因素协同作用分析

由表3可知，回归方程中只有X1X3和X2X3影响达到极显著（P=0.00511＜0.1，P=0.000＜0.1），因此对X1X3和X2X3的交互作用进行响应曲面分析。

图8 pH值和温度对紫菜粗多糖提取率的影响

图9 时间和温度对紫菜粗多糖提取率的影响

由图8可以看出，pH值4.0～4.75范围内，随着温度的升高，紫菜粗多糖提取率呈下降趋势；而当pH值在5.25～6.5范围内，随着温度的升高，紫菜粗多糖提取率呈上升趋势。在pH值为6、温度为65℃时，紫菜粗多糖提取率达到最大值3.255%。

由图9可以看出，温度在45-47.5℃范围内，随着时间的增加，紫菜粗多糖提取率增加；当温度在47.5-60℃范围内，紫菜粗多糖提取率随时间增加呈先增加后减少的趋势；当温度在60-65℃范围内，随时间增加，紫菜粗多糖提取率下降。在温度为45℃、复合酶解时间为65min和温度为65℃、复合酶解时间为70min时，紫菜粗多糖提取率均达到最大值2.9358%。

3 结 论

在单因素实验的基础上，通过二次通用旋转组合设计优化了复合酶法提取紫菜粗多糖的提取工艺条件为：在料液比为1:40、pH 4.0的条件下，添加含5%纤维素酶和5%果胶酶的复合酶，65℃恒温酶解150min（纤维素酶30min、果胶酶120min），所得紫菜粗多糖提取率为4.78%。

[1] 张文浩，赵盛龙，吴常文.海洋生物—藻类[M]. 杭州:浙江大学出版社，2002．

[2] 王奇欣.福建省坛紫菜加工产业化发展思路[J]. 福建水产，2005，6（2）：71-73．

[3] 张朝燕，刘承初等.天然紫菜多糖复合保健饮料的制备工艺研究[J]．时珍国医国药，2007，18（12）：2887-2888．

[4] Fleurence J. Seaweed proteins: biochemical, nutritional aspects and potential uses [J]. Trends in Food Technol, 1999，(10): 25-28．

[5] 赵保力，张英锋，李长江，等.紫菜多糖的提取及化学成分[J]．化学教学，2010(3):52-55．

[6] 周慧萍，陈琼华．紫菜多糖的抗凝血和降血脂作用[J]．中国医科大学学报，1990，21（6）：358-360．

[7] 周慧萍，陈琼华．紫菜多糖抗衰老作用的实验研究[J]．中国医科大学学报，1989，20(8)：340．

[8] 周慧萍，陈琼华．紫菜多糖对实验性血栓和心肌收缩力的影响[J]．中国医科大学学报，1991，22(1)：50-52．

[9] 谢三都，熊荣华．响应面法优化金银花水溶性多糖提取工艺条件[J]．农产品加工学刊，2013（1）：38-41．

（责任编辑：季平）

Optimization of Extraction Process of Porphyra Crude Polysaccharides by Quadratic General Rotary Unitized Design

GUO Meng1, XIE San-du2, YE Li-shu2

(1. Department of Food and Biological Engineering, Zhangzhou Institute of Technology, Fuzhou Zhangzhou,363000, China; 2. Department of Chemistry and Life Science, Minnan science and Technology Institute, Fujian Normal University, Fujian Quanzhou, 362332, China)

With multiple enzyme method, the extraction conditions of crude polysaccharide from(CPP) were optimized by the quadratic general rotary unitized design based on single factor. The result show that the optimum extraction conditions for CPP are as follow: 1∶40 solid-liquid ratio (mg/mL), added compound enzyme consisting of 5% cellulase for 30min and 5% pectinase for 120min at the condition of 65℃ and pH4.0. Under these conditions, the extraction rate of CPP was 4.78%.

Porphyra yezoensis; crude polysaccharide; cellulase; pectinase; quadratic general rotary unitized design

2014－04－10

郭 萌（1984－），女，湖北襄阳人，助教，本科，主要从事食品科学的教学及科研工作。

1673-1417（2014）02-0008-07

10.13908/j.cnki.issn1673-1417.2014.02.0002

TQ464.1

A