吡咯喹啉醌对大型溞繁殖、发育、存活和抗饥饿能力的影响

张 鹏， 杜 阳， 孙静娴， 邢晓磊

(大连海洋大学 辽宁省水生生物学重点实验室，大连 116023)

吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，简称PQQ)，是烟酰胺核苷酸(NAD+和NADP+)和黄素核苷酸(FAD和FMN)之外的第3种有机辅基。自20世纪70年代末其化学结构被确认以来，PQQ的相关研究已经开展了近35年。研究发现，PQQ既是一种植物生长促进因子[1,2]，也是哺乳动物生长、发育和繁殖的重要营养物质[2-6]。这种由某些细菌产生的小分子醌化合物，以皮摩尔或纳摩尔水平，存在于各种植物、动物甚至人体组织内[7,8]。目前认为，动物和人体肠道菌群不能合成PQQ或合成量远远不能满足机体需要，其体内的PQQ主要是通过外源性饮食途径获得。日本学者曾建议将其列为一种新的B族维生素[9]，但这一提法学术界尚存在争论[10-12]。迄今为止，PQQ生理功能的研究已经在国内外广泛开展，但其对水生生物是否能够发挥生理作用，亦或者水生生物能否对PQQ产生生理响应，尚不清楚。本文以国际公认的标准试验生物大型溞(Daphniamagna)为受试对象，通过外源性添加PQQ，分析其对溞类个体繁殖、寿命和抗饥饿能力的影响，旨在揭示PQQ对水生甲壳类动物的生理作用，为其将来在水生生物学领域的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

PQQ(纯度≥98%)购于上海医学生命科学研究中心有限公司，使用时用超纯水配制成3 mmol/L的储备液,用一次性无菌注射器和0.22 μm孔径的滤膜过滤后，4℃冰箱贮存备用。试验用溞由辽宁省水生生物学重点实验室提供，实验室内用灭菌的自来水培养，以单细胞微藻斜生栅藻(Scenedesmusobliquus)为食物，连续孤雌生殖繁殖同步幼溞。

1.2 方法

1.2.1 繁殖、发育与存活试验

收集24 h以内出生的同步幼溞，随机分配于12孔细胞培养板内，每孔1只，孔内含有3 mL无菌水，以浓缩的微藻作为食物，投喂密度为4×105个细胞/mL,投喂频率为每天1次，25℃±1 ℃恒温培养。试验设立3个PQQ处理组，浓度分别为5、15和25 μmol/L，对照组不加PQQ，每组6个平行。每天观察记录溞脱壳和产卵情况，当溞开始繁殖后，及时移出新产的幼溞并记录数量。每2 d更换1次试验用液，连续试验直至所有溞体全部自然死亡。

1.2.2 饥饿试验

收集肠道食物已经排空的3龄同步溞，随机分配于100 mL烧杯中内，每个烧杯10只，杯内含有30 mL无菌水，不投喂任何食物，20℃±1℃恒温培养。试验设立3个PQQ处理组，浓度分别为0.1、0.5和1 mmol/L，对照组不加PQQ，每组3个平行。每天观察记录各组溞个体死亡数量，并移出死亡个体。每天补充蒸发的水分保持液面体积恒定，连续试验直至所有溞体全部死亡。

1.3 统计分析

应用SPSS 15.0对数据进行单因素方差分析，LSD法分析组间显著性差异，P值小于0.05视为差异显著。

2 结果

2.1 PQQ对大型溞繁殖的影响

与对照组相比，不同浓度的PQQ对大型溞的首次怀卵时间、首次产卵时间与首次产幼量均无显著影响(P>0.05)，PQQ各处理组之间亦无显著差异(表1)。

由表2可知，5 μmol/L的PQQ能够显著提高总产幼量(P<0.05)，15 μmol/L的PQQ则显著提高了平均每窝产幼量(P<0.05)。组间差异性分析表明，15 μmol/L PQQ处理组的总窝数显著低于5 μmol/L PQQ处理组(P<0.05)，25 μmol/L PQQ处理组的总窝数和总产幼量均显著低于5 μmol/L PQQ处理组(P<0.05)。

表1 不同浓度PQQ处理下大型溞的首次繁殖参数

表2 不同浓度PQQ处理下大型溞的总体繁殖能力

不同小写字母表示各处理组与对照组差异显著，不同大写字母表示各处理组之间差异显著(P<0.05)，下同。

2.2 PQQ对大型溞发育与存活的影响

由表3可知，不同浓度的PQQ对大型溞发育过程中的幼龄数、成龄数、总龄数以及存活时间均无显著影响(P>0.05)。组间差异性分析表明，15和25 μmol/L PQQ处理组的成龄数、总龄数和存活时间均显著低于5 μmol/L PQQ处理组(P<0.05)，而3组间的幼龄数则无显著变化(P>0.05)。

表3 不同浓度PQQ处理下大型溞的龄期和存活时间

2.3 PQQ对大型溞抗饥饿能力的影响

表4 饥饿条件下PQQ对大型溞抗饥饿能力的影响

由表4可知，饥饿条件下，不同浓度的PQQ对大型溞的初始死亡时间无显著影响(P>0.05)，但日均死亡数均显著降低(P<0.05)，而0.1 和0.5 mmol/L PQQ处理组的最长存活时间和半数死亡时间LT50均显著高于对照组(P<0.05)。组间差异性分析表明，0.1 和1.0 mmol/L PQQ处理组的最长存活时间显著低于0.5 mmol/L PQQ处理组(P<0.05)，两者的日均死亡数则显著高于0.5 mmol/L PQQ处理组(P<0.05)。3组间的LT50值均有显著差异(P<0.05)。

由图1的存活曲线可以看出，对照组溞在饥饿后第2天大量死亡，仅有2只个体存活，而0.1 和0.5 mmol/L PQQ处理组溞的存活个体数分别为8.33只和9只。饥饿后第3天对照组溞全部死亡，而3个PQQ处理组的溞个体仍有存活，其中以0.5 mmol/L PQQ处理组的存活数达到了5.33只。随着时间的延长，0.5 mmol/L PQQ处理组溞的存活数缓慢下降，显示出了较好的抗饥饿效应。

图1 饥饿条件下大型溞的存活曲线

3 讨论

3.1 PQQ对大型溞繁殖、发育与存活的影响

研究表明，饮食中缺乏PQQ会导致试验小鼠和大鼠出现一系列的不良反应，包括新生幼鼠生长发育受损，免疫功能缺陷和母鼠繁殖能力下降等[2-6]。近年报道显示，饮食中添加PQQ能够促进母鸡产蛋率和提高蛋质量，同时增强母鸡的抗氧化应激能力[13]。本研究表明，PQQ能够增强大型溞的繁殖能力，以5 μmol/L浓度效果最好，表现为总产幼量显著增加。这与哺乳动物和禽类的研究结果相类似。PQQ对大型溞的首次怀卵时间、首次产卵时间与首次产幼量均无显著影响，这说明其促繁殖作用主要发挥于繁殖中后期。以前的研究证明，PQQ既是一种强抗氧化剂，也是一种强促氧化剂，因此被认为是“双面”分子[14]。PQQ的最终效应取决于其作用浓度和所处的微环境[15,16]。本研究显示，PQQ浓度增加到15 和25 μmol/L会导致其促繁殖效应的下降，主要反映在总产幼量和总窝数的减少，因此推测PQQ浓度过高可能会对动物的繁育起到负面作用。PQQ对大型溞的龄数和存活时间无显著影响，但值得注意的是，与5 μmol/L浓度组相比，15 和25 μmol/L的PQQ显著降低了大型的龄数和存活时间，这种浓度依赖效应与繁殖试验所得到的结果类似，提示高浓度的PQQ很可能还会显著影响动物的发育过程，降低动物的存活时间(寿命)。

3.2 PQQ对大型溞抗饥饿能力的影响

由于自然界中环境的变迁、季节更替以及食物在时空上的不均匀分布性，动物在其生命周期中经常面临食物资源的短缺而受到饥饿胁迫。甲壳类是水生动物中的一个主要类群，其饥饿生理的研究由来已久[17,18]。线粒体是细胞的能量工厂，同时也是内源性氧自由基产生的主要细胞器。全饥饿条件下，机体的外界能源物质供给中断，线粒体内的能量代谢方式发生转变，氧自由基过度产生，机体内环境平衡被打破，这是导致动物机体死亡的主因。本研究表明，PQQ能够保护大型溞免受饥饿胁迫损伤，表现为饥饿溞体的存活时间明显延长，LT50值升高以及日平均死亡个体数的降低。其中，以0.5 mmol/L浓度的PQQ 作用效果最为明显。PQQ与线粒体之间的关系已经有过很多研究，并已成为PQQ生物学功能机理研究的热点之一。PQQ能够保护线粒体免受氧化损伤，调节线粒体的质量和功能，逆转线粒体复合体Ⅰ抑制剂二亚苯基碘DPI的抑制作用等等[6,19-21]。线粒体的生物发生是由过氧化物酶体增殖活化受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)和核呼吸因子(NRF)等转录因子共同调节。PQQ能够激活PGC-1α启动子，增加其mRNA和蛋白表达，并增强PGC-1α通路中NRF1、NRF2、Tfam、TFB1M、TFB2M等其他转录因子mRNA的表达，从而增加线粒体发生和氧化代谢水平[21,22]。因此，我们推测PQQ的抗饥饿应激效应与其调节线粒体功能密切相关。

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