大花蕙兰组培快繁技术研究

樊家荣， 孟想想， 曹 可

(合肥学院 生物与环境工程系，合肥 230601)

大花蕙兰(Cymbidium)为兰科植物，又称虎头兰，株型高大优美，花期长达2～3个月，花大色彩艳丽丰富，花朵数多排列有序，花姿粗旷豪放，叶长碧绿优雅，它既有国兰的幽香典雅，又有洋兰的丰富多彩，具有较高的观赏和经济价值，深受兰花爱好者欢迎，在国际花卉市场十分畅销[1-3]，市场发展前景远大。花大色艳新品种多数为兰属的杂交种多倍体[3-4]，种子高度不育，分株繁殖速度慢，远不能满足市场需求，采用组织培养是快速繁殖大花蕙兰种苗的有效途径。我国云南、沿海地区从20世纪末就开始进行组织培养研究[5-6]，已取得可喜的成绩，据了解本地未曾有人研究大花蕙兰组织培养，至今还是一花难求。

实验采用1/2MS[3-6]为基本培养基，选用大花蕙兰杂交种1053新生苗为外植体，对大花蕙兰组培关键阶段：类原球茎诱导、类原球茎增殖与分化、芽增殖、诱导生根培养的最佳激素浓度配比、有机添加物等影响因素进行研究，优化后的大花蕙兰组培快繁种苗技术，具有繁殖率高、周期短、成本低等优点，可提高市场竞争力，促进本地大花蕙兰产业发展。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大花蕙兰1053品种购买于云南呈贡斗南花卉市场，无菌瓶苗由本实验室培养，以盆栽的新生苗、无菌苗茎段和叶为外植体。

1.2 实验方法

1.2.1 基本培养基

采用1/2MS+蔗糖20 g/L+琼脂8 g/L+Vc5 mg/L，pH值5.8。

1.2.2 大花蕙兰类原球茎诱导

1)培养基：基本培养基添加150 ml/L椰汁，设计6-BA(0.3、0.5、1.0、1.5 mg/L)和NAA(0.2、0.5 mg/L)6种不同浓度组合的培养基(表1)。

2)外植体制备与接种：鳞茎取自盆栽大花蕙兰长有5～6片叶的新生苗，连稍微膨大的假鳞茎一起挖取，用自来水冲洗干净，剥取内层假鳞茎，在超净工作台中。先用75%的酒精浸泡35 s，再用0.1%的升汞[7-8]浸泡9 min，无菌水浸泡4～5 min、冲洗2次。切去表层，以茎尖生长点为中心切取直径约0.6 cm组织块，每瓶接种1块。幼叶横切成长0.8 cm的片状，每瓶接种10片；茎节切成1 cm长的小段，每瓶接种4段，培养50 d统计结果。

3)培养条件：温度为昼26℃、夜20℃；光照时间12 h/d，光照强度为1500 lx。

1.2.3 类原球茎增殖与分化芽

基本培养基添加椰汁同上，设计6-BA(0、0.3、0.5、1.0、1.5 mg/L)和NAA(0、0.2、0.3、0.5 mg/L)7种不同浓度配比培养基(表2)。选择颗粒饱满、色泽黄绿的类原球茎为外植体，分割4个一组，每瓶接种5组，培养45d统计结果。

1.2.4 大花蕙兰幼芽增殖

将幼芽分割成两个1组，每瓶接种2组，每种培养基接25瓶，培养50 d统计结果。

1)激素浓度对芽增殖的影响 设计6-BA(1.0、2.0、3.0 mg/L)和NAA(0.1、0.2、0.5、1.0 mg/L)7种不同浓度配比的培养基(表3)。

2)有机添加物对芽增殖的影响 选用芽增殖最佳的激素浓度配比6-BA 2.0 mg/L、NAA 0.5 mg/L，设计添加物分别是椰汁(100、150、200 ml/L)、香蕉泥(100、150 g/L)，无添加物的为对照组6种培养基(表4)。

3)芽增殖正交试验 采用三因素三水平正交试验(表5)，探讨出影响芽增殖因素的主次顺序和最优组合(表6)。

1.2.4 大花蕙兰幼苗诱导生根

基本培养基添加香蕉泥100 g/L，设计IBA(0.1、0.3、0.5 mg/L)和NAA(0、0.1、0.2、0.4 mg/L)6种不同激素浓度的培养基(表7)。待幼苗长有3～4片叶、高3～4 cm、苗体健壮时，分割成单株接入诱导生根培养基。

2结果与分析

2.1 大花蕙兰类原球茎诱导结果

表1 3种外植体诱导类原球茎的结果

实验结果(表1)：外植体鳞茎接种3周后长出针尖大的绿色颗粒，约5周形成类原球茎。2号培养基接种鳞茎的茎尖，只诱导出少数类原球茎并伴有分化芽的趋势(图1-1)；接种的鳞茎组织块培养约7周诱导出许多类原球茎(图1-2)，颜色黄绿、幼嫩饱满；接种的茎段培养2～3周两端长出淡黄色的愈伤组织，之后生长慢，多数褐化，只有少数能形成类原球茎，个别茎节处潜在的芽原基长出1～2个芽；幼叶诱导未果。实验表明：最佳外植体为鳞茎，添加低浓度的6-BA、NAA，比值在1.5～5的范围内均可诱导出类原球茎，2号培养基激素浓度配比6-BA 0.5 mg/L + NAA 0.2 mg/L最佳。

2.2 大花蕙兰类原球茎增殖与分化芽的结果

表2 激素浓度对类原球茎增殖与分化芽的影响

实验结果(表2)：培养基无外源激素或添加激素浓度低，类原球茎增殖率偏低，生长状态差，分化的芽少；6、7号培养基激素浓度高，类原球茎增殖倍数有所下降。合适的激素配比类原球茎增殖与分化芽可同时进行[9]。综合考虑5号培养基6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.3 mg/L最佳，增殖的类原球茎个大饱满数量多，黄绿鲜亮，分散性好，分化的芽体健壮，有利于继代培养。45 d 继代培养1次可获得大量类原球茎，适当延长培养时间，60 d左右转接1次可收获更多的芽。

图1 大花蕙兰类原球茎诱导和芽增殖

表3 不同激素浓度对幼芽增殖的影响

2.3 大花蕙兰幼芽增殖的结果

1)激素对幼芽增殖的影响：

实验结果(表3)，6-BA对芽增殖作用大，随6-BA浓度升高，芽增殖数量增加，当超过3 mg/L时，芽体瘦弱发黄，与低浓度NAA配合使用，促进芽增殖与生长作用更显著，6-BA(1～2.0)mg/L、NAA(0.2～0.5)mg/L、两者比值在3～10的范围内，均能促进芽增殖。不同激素因子之间存在复杂的协同作用[10-12],单独使用6-BA或NAA增殖效果都不理想。相比5号培养基激素浓度配比6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L最佳，芽增殖倍数高，芽体健壮，色泽翠绿鲜亮(图1-3)。

表4 添加物对幼芽增殖的影响

表5 因素水平

2)添加物对幼芽增殖的影响：

实验结果(表4)，培养基添加椰汁和香蕉泥均能促进芽生长[13-15]，3号培养基芽增殖倍数高，芽体健壮，色泽翠绿(图1-4)，相比添加椰汁150 ml/L最佳。

3)芽增殖正交试验结果(表5、6)：

正交验证试验结果(表6)，由R值大小可以看出本实验因素存在显著的影响差异，主次顺序为：A>C>B， 即6-BA>椰汁添加物>NAA，6-BA浓度对大花蕙兰芽增殖的影响最大。优组合为：A2B2C2，优水平为：6-BA2 mg/L、NAA0.5 mg/L、添加物椰汁150 ml/L。

2.4 大花蕙兰幼苗诱导生根结果

表6 三因素三水平正交验证试验结果

表7 激素对幼苗生根的影响

实验结果(表7)，培养基单独添加IBA，随浓度升高根的诱导率增高，苗体瘦弱生长缓慢；5号培养基低浓度IBA与NAA协同作用生根多、根健壮，生根率100%，平均每株4～5条根；当激素浓度升高IBA 0.5 mg/L、NAA 0.4 mg/L时，生根率虽高，根畸形膨大，移栽不易成活。实验表明：影响幼苗生根的主要因素是生长素的种类与水平，5号培养基激素配比IBA 0.3 mg/L + NAA 0.2 mg/L最佳，添加100 g/L香蕉泥促进幼苗根生长作用显著。

3 结论

通过对影响大花蕙兰组培快繁的单因素和正交试验研究，优化得出：类原球茎诱导最佳外植体为大花蕙兰鳞茎，培养基最佳激素浓度配比为0.5 mg/L 6-BA + 0.2 mg/L NAA。类原球茎增殖与分化芽最佳激素浓度配比为1.0 mg/L 6-BA + 0.3 mg/L NAA。幼芽增殖的最佳激素浓度配比为2.0 mg/L 6-BA + 0.5 mg/L NAA，最佳有机添加物为150 ml/L椰汁；幼芽增殖正交试验结果，影响因素主次顺序：6-BA>椰汁添加物>NAA，优组合为2 mg/L 6-BA、0.5mg/L NAA、添加物椰汁150 ml/L。诱导生根最佳激素浓度配比为0.3 mg/L IBA + 0.2 mg/L NAA，添加100 g/L香蕉泥对幼苗根生长有显著的促进作用。优化后的大花蕙兰组培快繁技术，种苗繁育周期短、繁殖率高、成本低，可供大花蕙兰快速繁殖规模化生产参考。

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