烟草与罗勒科间远缘杂交育种的研究

杨进文，魏治中

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

科间远缘杂交是引进外源基因、创造变异、拓宽烟草品质及抗性育种遗传基础的有效手段之一，也是形成新物种的重要途径。因此，利用药用植物与烟草进行科间远缘杂交，培育含医药成分的新型烟草，以期达到通过吸烟对某些疾病起到一定的缓解作用，育种实践证明培育这样的新型烟草是可行的。我国远在殷商时期已利用“燃、熏、吸”中草药的方法治疗某些疾病，并沿用至今，效果良好。这说明我国很多中草药具有安全无毒，可以随烟气吸入人体起到某些治疗作用。我国药物型卷烟研讨会(1986年8月24日)纪要中指出：“经临床试验，观察，药物型卷烟对某些疾病具有一定的缓解作用，因而受到患有某些疾病，但又难以戒除吸烟习惯的消费者的欢迎”。可以肯定，培育含多种医药成分的新型烟草，与目前药物型卷烟相比，可以节省大量中草药，降低卷烟成本费用，其发展前景是广阔的。新型烟草问世，不仅为烟草育种开辟了新途径，对生物遗传理论的研究也具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 试验材料

罗勒(唇形科,N=24,Comunbailicuml)含植物醇、柠檬烯、罗勒烯、β-丁香烯等医药成分，具有止咳、平喘、抑癌、解毒、消炎、止痛等功效；普通烟草(茄科N=24,NicotianatobacumL)；红花烟：烤、晒兼用品种，抗逆力强，早熟，产质较好；78-05：早熟品种，有一定香气，落黄快，抗逆力强。

1.2 方法

采用无性嫁接与有性杂交相结合的方法进行远缘杂交。

1.2.1 染色体鉴定

取花蕾长度4～9 mm，放入混合溶液中(95%酒精∶氯仿∶冰醋酸=6∶3∶1，体积比)，固定24 h，然后投入70%的酒精中，置4℃条件下贮存48 h，制片观察，显微镜下拍照。利用萌发的种子幼根，长约2 mm，将萌发种子整体投入饱和的对二氯苯溶液中，预处理2 h，然后用卡诺氏溶液固定20 h，再转入70%酒精中贮存备用。制片时，将根尖用5 N HCl在常温下解离10 min，45%的醋酸软化15 min，再用醋酸洋红染色压片，然后立即观察体细胞染色体并在显微镜下拍照。

1.2.2 同工酶分析鉴定

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)法分析脂酶同工酶和过氧化物酶同工酶。

1.2.3 医药成分测定

检验设备：色-质联机，检测依据：四极质谱分析方法通则，对其挥发油进行定性、定量分析。

1.2.4 单料卷烟的烟气定性定量检测

采用检测设备为色-质联机，检测依据：四极质谱分析方法通则。

1.2.5 烟叶化学成分测定

采用化学连续自动分析仪(比色法)，原理是依据光对各种化学成分吸收程度的不同而得到结果。

1.2.6 卷制成品烟气检测及评吸

卷制成品烟气检测由国家烟草质量监督检测中心进行，卷制成品的评吸由郑州烟草研究院评吸委员会进行。

2 结果与分析

2.1 远缘杂交

2.1.1 无性与有性杂交相结合

利用砧木影响接穗的新陈代谢，促进雌蕊接受花粉的代谢作用，采用无性与有性杂交相结合的方法，结果表明，提高了杂交成功率，并增加了蒴果中的种子数量及千粒重(表1)，反映出该杂交方法有利于双亲基因间的渐渗和交流。如果结合重复受粉，其蒴果中种子数量增加更明显。多数杂种一代回交后，千粒重、种子数量都有增加的趋势。

表1嫁接后有性杂交对蒴果中种子数量和千粒重的影响

Table1 The effect of graft and hybridization on tobacco ftuit

材料Stuff单果种子粒数Seed numbers千粒重1000 weight/g红花烟1371.00.0932罗勒4.03.445红花烟×罗勒秕子(番茄+红花烟)×罗勒429.00.05828(番茄+红花烟)×罗勒BC1808.00.06457

2.1.2 最佳授粉环境的选择

研究结果表明(表2)，烟草与罗勒科间远缘杂交，在早晨或傍晚温度较低(22～25℃)、相对湿度较大(70%～80%)的环境条件下，杂交成功率较高。选择低温、高湿环境进行人工授粉是烟草与药用植物科间杂交的重要条件之一，如果结合重复授粉，更利于提高杂交的成功率 。

表2 不同温度和湿度条件下杂交成功率比较

2.1.3 烟草品种杂交亲本的选择

烟草远缘杂交实践表明，利用烟草品种与罗勒进行科间远缘杂交，常因烟草品种不同，杂交成功率差异很大。有些品种杂交后，蒴果中种子数量的多寡差异悬殊(表3)。有些烟草品种杂交后，能结蒴果，但无种子。因此，深入探讨烟草品种杂交后的亲和性，对开展烟草远缘杂交育种至关重要。

表3 不同烟草品种的杂交效果

2.2 杂种的育性及其性状表现

2.2.1 杂种植株部分不育

杂种F3之前的群体中约5%的植株只开花不结种子。开花期间，花易落，并有部分花蕾枯萎，花序小，一般每个花序只有1～3朵花，但花朵大，雌蕊2枚，雄蕊5～6枚。

2.2.2 杂种植株完全能育

F3以前的群体能育植株中，其主要植物学性状具有不同程度变异，主要表现为生育期缩短，烟草与罗勒杂交的部分杂种后代中，花朵大，雌蕊6枚，雄蕊1～3枚，花冠有裂缝，花冠弯曲。在能育的植株中，约70%的植株花序较大，且松散，生育期与亲本之一的烟草相近；靠近花序的一片叶子较大且呈月牙形，并围绕花序生长；腋芽生长势强，腋芽数量多，这与药用植物罗勒的特性有直接关系。杂种F3代之前，蒴果大、果柄长、花萼大、蒴果中种子数量较少，一般500～1200粒。F7代之后这种变异很少见，杂种F7～F12的部分株系，在30℃左右环境条件下开花、结蒴果并有种子，15～20℃的环境条件下，易落花、落果，甚至只开花不结种子，花朵小，花柱短，但人工回交授粉后易结蒴果并有少量种子。

2.2.3 杂种主要农艺性状的表现

根据育种目标对杂种后代的逐代选择，F10以后其主要农艺性状，如植株高度、叶片大小、单株叶数、生育期、株型等与亲本之一的烟草相似，只有个别性状倾向于药用植物亲本，如叶形、叶色深绿、腋芽生长数量多、叶片脆等，见图1。这些现象在烟草与药用植物科间杂种后代及其稳定品系中，屡见不鲜。

图1 烟草与罗勒科间杂种性状变异Fig.1 Variation of Traits distant hybrid between tobacco and Coimum bailicm L

2.3 细胞染色体的鉴定

镜检结果表明(图2)：杂种F1，回交一代至二代及其稳定品系，其细胞染色体皆呈杂合状态，但不同的杂交组合及其后代，细胞染色体的杂合程度相差较大。如(番茄+红花烟)×罗勒，该杂交组合F1花粉母细胞染色体数目有10个类型：分别为N=20，22，24，260，32，34，36，38。该杂交组合的双亲花粉母细胞染色体皆为N=24。而F1中N=24的只占30%左右，并且在一些细胞染色体中有非整倍体存在，当采用药用植物亲本罗勒(N=24)回交，其回交一代(BC1)在染色体数目类型中，F1的染色体数目类型N=24由30%左右增加到61.10%。从F8～F15有许多株系的主要农艺性状渐趋稳定，主要农艺性状的标准差和变异系数与对照烟草品种G-28和NC95基本接近。F18代的细胞染色体仍呈杂合状态。这种现象在烟草与紫苏(唇形科)、薄荷(唇形科)、土人参(马齿苋科)、黄芪(豆科)的科间远缘杂交种后代中具有普遍性。

图2 罗勒及其杂种后代稳定品系的染色体数目Fig.2 Chromosome numbers of stable lines between Coimum bailicm L and hybid progeny

2.4 酶谱测定

为确定药用植物亲本罗勒的遗传信息是否已进入杂种后代中，对稳定品系及其双亲进行了酶谱测定。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)方法，对酯酶同工酶进行多次分离、分析。结果表明(图3)，共16条谱带，其中，子代罗勒烟与父本有5条共同带，三者有3条共同带。即父母本的遗传物质分别遗传给了子代，由于双亲基因互作，子代产生了新带，说明罗勒烟是红花烟和罗勒杂交的后代。实验重复3次，结果相同。

图3 罗勒烟及其双亲酯酶酶谱Fig.3 Esterase isozyme zymogram figure of Coimum bailicm L Tobacco

2.5 医药成分的测定

测定结果表明(表4，由吉林大学基础医学院化验测定)：烟草与药用植物科间远缘杂交后，药用植物的医药成分遗传给杂种后代的能力是不同的。由于双亲基因互作，杂种后代稳定品系罗勒烟产生了新医药成分(松油醇和金合欢烯)及香料成分(古云烯-γ-环氧化物)。

表4 罗勒烟及其亲本医药成分测定

2.6 化学成分的测定

灵丘县4个普通烤烟样品及垣曲县5个烤烟品种与在该地区连续3年种植的罗勒烟，对其进行比较(表5)。在灵丘种植的罗勒烟，总糖4.11%，烟碱3.06%；在垣曲种植的罗勒烟，总糖14.83%，烟碱2.51%，分别比普通烟草品种的总糖含量低29.92%和11.76%，而烟碱分别高2.22%和0.26%，反映出罗勒烟具有低糖，中、高烟碱的特点。

表5 普通烤烟与罗勒烟化学成分的比较

罗勒烟烟味发酵前后测定结果表明(表6)：新型烟草在发酵后总糖，总碱，总氮，挥发碱等化学成分比发酵前均有所提高，而普通烟草品种在发酵后上述化学成分比发酵前有所降低。这说明新型烟草与普通烟草品种是有区别的。

根据漯河卷烟厂利用罗勒烟烟叶3年试制与评吸结果，并未发现独特的药物香气等内在质量的变化。

表6 发酵后新型烟草的化学成分

2.7 单料烟烟气的检测

对新型烟草烟叶，用单料烟卷制成的烟支，燃烧后，检测烟气的医药成分种类及含量，结果表明：产生了一系列新的对人体有益的医药成分，如表7所示。

表7 单料烟烟气医药成分的测定

2.8 罗勒烟的可用性鉴定

可用性是衡量烟草品种的利用价值和育种水平的重要标志。罗勒烟经省内外试验和示范，推广，其产量与普通烟草品种相似，而药物香气，颇受欢迎。

2.8.1 产、质量情况

罗勒烟，一般单叶重6～8 g，产量1800～2100 kg·hm-2(表8)。漯河卷烟厂利用3年的时间，对其进行反复探索，在卷烟配方中，新型烟草比例达到10～15%，卷制成品吸食口味既有烤烟型香烟的优良品质，又透出一种诱人的药物香味，试制出“大得利”牌香烟，经试销，好评如潮。

表8 罗勒烟的产、质量情况

2.8.2 烟气检测结果

国家烟草质量监督检测中心对“大得利”牌卷烟进行检测，结果见表9。对照和2种样品烟气中烟碱含量分别为1.52，1.10和1.31 mg·支-1; 焦油含量分别为17.7,11.2和11.1 mg·支-1; CO含量分别为16.7、12.6、12.9 mg·支-1。说明2种样品在烟碱、焦油、CO的含量中，都比对照低。这表明焦油含量10 mg·支-1，烟碱含量1.1 mg·支-1上下。目前，“大得利”牌香烟属于低焦油卷烟类型。

表9 烟气检测结果

2.8.3 评吸结果

迄今，卷烟成品的评吸以鉴定其质量的优劣，目前尚无法代替，也是比较科学的方法。漯河卷烟厂利用罗勒烟等新型烟草在卷烟配方中的科学配伍，使“大得利”牌香烟，呈现出香气细腻柔和，口感纯正舒适，余味甜润丰满，药物香气流畅的品质特征。经郑州烟草研究院评吸委员会评吸，结果列于表10。罗勒烟经上述医药成分测定，烟气检测及评吸，化学成分分析，初步认为，他们具有4个显著特点：含医药成分，有特殊香气，中、高烟碱与低糖，可用性较理想。

表10 评吸结果

3 结论与讨论

(1)利用药用植物与普通烟草科间进行远缘杂交，首次采用无性嫁接和有性杂交相结合的方法，解决了科间远缘杂交不亲和的难题。选育出罗勒烟稳定品系。由于各性状的遗传力不同，烟草主要农艺性状的变异范围有差别，性状稳定的快慢也不一致。为此，按照育种目标，对单株性状的选择采取了早代(F1～F7)宽松，晚代(F8开始)严格的原则，决定单株或群体的取舍。

(2)单料烟评吸结果表明：罗勒烟分别具有特殊的香气，为卷烟产品的开发和设计特殊风格的卷烟提供了新的原料。

(3)罗勒烟经医药成分测定、烟气检测及评吸和化学成分分析初步认为：罗勒烟含医药成分；有特殊药物香气；烟碱含量中、高，糖含量低；烟叶可用性较理想。

(4)罗勒烟的烟叶在发酵前后其化学成分的变化与普通烟草品种烟叶是有区别的。熟悉这一特点，对卷烟企业用料是有益的。当前，利用化学成分鉴定烟叶的质量指标，采用糖碱比(10∶1)，氮碱比(1∶1)。一般认为，氮碱比增大，烟叶颜色变淡，烟气吃味逐渐减少，接近1∶1，则烟气严重不足，低于1∶1时，烟味较浓，但刺激性逐渐增加。据漯河卷烟厂试制结果可知，并未发现罗勒烟独特的药物香气等内在质量的变化，反映出利用上述化学成分指标鉴定罗勒烟叶质量，值得今后进一步探讨。

(5)烟草与药用植物科间杂交育种后代F1到F18的细胞染色体均呈杂和状态。这可能是由于控制性状的主要染色体和非主要染色体共处同一细胞中，从而使杂种后代的主要农艺性状与烟草相似，只有个别性状倾向药用植物亲本。其化学成分中既有烟草固有的化学成分(尼古丁等)，也含有微量的医药成分柠檬烯，β-丁香烯，罗勒烯等以及香料成分香薷酮等。

(6)前人对远缘杂交的研究认为远缘杂交分3种类型：一类是子代中有双亲的两类染色体的异源双二倍体杂种，子代的外部性状常表现为双亲中间型，如八倍体小黑麦；第二类是在母本染色体组的的基础上，通过添加或代换的方式增加了异源染色体的个别片段的成分，如某些小偃麦。第三类是亲缘关系更远，如水稻，玉米，高粱等杂交的后代，在光学显微镜下观察其染色体数目、形状和大小与母本相似，基本上属于母本类型。如高粱稻，外形与水稻相似，后代杂种与水稻基本相同，但在株、穗型等方面的表现却不同于母本。这种现象从经典遗传学理论上很难解释，但从局部DNA分子观察，部分基因间的结构却可能保持一定的亲和性。因而，当远缘DNA片段在母本复制过程中，有可能被重组而使子代出现变异，因此，从分子水平上分析，能取得成功的远缘杂交的大多数是DNA片段的交换。本试验的杂种后代，主要农艺性已基本稳定，但其细胞染色体仍呈杂合状态，这一问题仍需要深入研究。

参 考 文 献

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