皂荚内生拮抗细菌的分离筛选及代谢产物分析

姚众，韩巨才，刘慧平，刘东，张宝俊

(山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801)

植物内生细菌是指在其生活史的一定阶段或全部阶段生活于健康植物根、茎、叶等组织的细胞间隙或细胞内的一类细菌，与宿主植物建立和谐联合共生的关系，是植物微生态系统的重要组成部分[1,2]。植物内生细菌中广泛分布着抗菌活性菌株，亦可产生具有生物活性的次生代谢产物。迄今为止，有关植物内生细菌抑制病原菌的研究已积累了大量资料，在防治真菌性病害、细菌性病害和线虫病害等方面发挥了巨大作用。Rauye Shwaran等[3]从鹰嘴豆、向日葵、辣椒植物茎内分离筛选到10株对镰刀菌、菌核菌、丝核菌有明显抑制作用的内生细菌；崔林等[4]从马铃薯组织内分离到55株对密执安棒形杆菌环腐亚种有拮抗作用的内生细菌；李进荣等[5]从大豆根瘤内分离出4株内生细菌对大豆胞囊线虫孵化有强烈的抑制作用。由于生物农药良好的应用前景及化学农药的过度使用存在环境污染、3R(Residue、Resistance、Resurgence)问题等，近年来从植物中分离筛选具有生防作用的内生细菌以已成为国内外研究的热点。

皂荚(GleditsiasinensisLam)是中国特有的苏木科皂荚属树种之一，是食品、化妆品、洗涤用品等的天然原料，亦是一种中药材，有祛痰止咳、开窍通闭、抗菌杀虫等药理作用[6]。目前尚未见对皂荚内生细菌有详细的研究报道。本研究对皂荚内生细菌进行了分离筛选，并对其代谢产物进行了分析研究，旨在筛选出能产生抑菌活性物质的内生菌，为皂荚的综合开发利用及寻找新的抗菌药物资源奠定基础。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 植物组织

供试的植物组织均采自山西农业大学健康皂荚树的枝、叶等不同部位。

1.1.2 供试培养基

PDA培养基、LB培养基、NA培养基。

1.1.3 拮抗指示菌

梨黑斑病菌(Alternariaalternata)、番茄早疫病菌(Alternariasolani)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.capsicum)、番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.niveum)、棉花立枯病菌(Rhizoctoniasolani)，均由山西农业大学农药学实验室提供。

1.2 试验方法

1.2.1 内生菌的分离纯化

将新鲜无病虫害的植物组织用清水冲洗干净后进行表面消毒处理[7,8]：75%的酒精浸泡3～5 min，无菌水冲洗3次，再在3%的次氯酸钠中浸泡3～5 min，用无菌水冲洗5次。取最后一次冲洗的无菌水200 μL涂布于平板培养基上做对照。将叶片用灭菌的解剖刀切成0.5 cm ×0.5 cm大小，茎部样品裁剪为0.5 cm左右的小段，用灭菌刀片纵向剖开，紧贴于NA培养基上于27℃恒温培养箱中培养。待材料周围长出菌落后，采用划线法分离、纯化，根据菌落形态、颜色等分类保存。

1.2.2 拮抗菌株的筛选

采用平板对峙法[9]：在PDA平板中央接入直径5 mm的病原菌菌块，距离菌块2 cm处的2个点对称接种细菌菌体，以不接细菌作为对照，25℃恒温避光培养5 d，观察病原菌菌落生长状况，测定菌落直径，分析细菌菌体对病原菌的抑制率。

1.2.3 拮抗菌株代谢产物分析

将分离到的内生细菌接种于LB培养液中，28℃、160 r·min-1振荡培养72 h，得到拮抗菌株发酵液。8000 r·min-1离心10 min去除菌体，上清液分2种方式进行处理[10]。方法1：0.45 μm微孔滤膜过滤灭菌；方法2：121℃高压湿热灭菌30 min。采用生长速率法测定各菌株的发酵液活性：将各处理发酵液按1∶9的比例与PDA培养基混合，制备平板，并在平板中央接入直径为5 mm的新鲜病菌菌块，5 d后测定菌落直径，计算抑菌率。以LB培养液为对照，每处理3次重复。

1.2.4 抗菌谱分析

用生长速率法对最终筛选的2个拮抗菌株ZJ4和ZJ7代谢产物进行抑菌广谱性测定。发酵液经滤膜过滤灭菌。

2 结果与分析

2.1 内生拮抗细菌的筛选

从所有分离获得的细菌中筛选、纯化得到26个菌株。以梨黑斑病菌和灰霉病菌为指示菌，用平板对峙培养法筛选出12株抑制率均高于60%的菌株为拮抗菌株，分别编号为ZJ1～ZJ12，其抑菌活性见表1。分离的12株内生细菌其菌体对梨黑斑病菌抑菌率最高的为ZJ4，抑制率达74.3%，其次为ZJ9，抑制率为67.6%；其菌体对番茄灰霉病菌抑菌率最高的为ZJ7，抑制率达74.6%，其次为ZJ4，抑制率为71.4%。

表1 12个菌株对梨黑斑病菌和番茄灰霉病菌的拮抗作用

Table1 Antagonism of 12 strains toA.alternataandB.cinerea

菌株Strains 对梨黑斑病菌抑制率Inhibition rate againstA.alternata/%对番茄灰霉病菌抑制率Inhibition rate againstB.cinerea/%ZJ167.565.5ZJ262.466.7ZJ363.363.9ZJ474.371.4ZJ564.663.9ZJ664.665.5ZJ767.574.6ZJ862.460.3ZJ967.666.7ZJ1067.568.3ZJ1165.863.9ZJ1266.363.9

2.2 拮抗菌株代谢产物分析

代谢产物对梨黑斑病菌抑菌活性见表2， 12个菌株的次生代谢物质对梨黑斑病菌的抑制作用差异较大，ZJ7菌株的无菌发酵液抑菌效果最佳，对梨黑斑病菌的抑制率达82.15%，其次是ZJ4，抑制率为80.26%，表明这2个菌株的次生代谢物中含有大量的抗菌物质。发酵液经高温灭菌处理后ZJ4、ZJ7的抑菌活性明显下降，推测该菌株可能代谢产生对热敏感的蛋白类物质；而ZJ1、ZJ2、ZJ5等菌株经高温处理后的抑菌活性无明显丧失，表明其抗菌物质对热不敏感，推测其抗菌物质可能为抗生素类或多肽类物质。ZJ4、ZJ7菌株活性高，可作为潜在生防菌进行后续研究。

表2 12个菌株代谢产物对梨黑斑病菌的拮抗作用

Table2 Antagonism of the metabolites of 12 strains againstA.alternata

菌株Strains过滤处理抑菌率Inhibition rate of filteredby 0.45μm filter/%高温处理抑菌率Inhibition rate oftreated by autoclaving/%ZJ144.2941.58ZJ250.0248.05ZJ362.3317.4ZJ480.264.08ZJ575.8568.05ZJ655.3640.25ZJ782.157.61ZJ859.2140.25ZJ945.5814.29ZJ1059.1840.14ZJ1172.5150.63ZJ1256.4612.93

2.3 ZJ4和ZJ7代谢产物抗菌谱分析

ZJ4和ZJ7菌株的抗菌谱测定结果见表3。2菌株对番茄早疫病菌、番茄灰霉病菌、梨黑斑病菌、棉花立枯病菌、辣椒枯萎病菌5种植物病原菌具有不同程度的拮抗作用，ZJ4菌株对梨黑斑病菌的抑制率最高，为83.99%，ZJ7菌株对番茄早疫病菌的抑制率最高，为82.58%，2菌株对西瓜枯萎病菌均没有抑制作用。2菌株对不同病原菌的抑制作用表现出一定的选择性，对链格孢属的番茄早疫病菌和梨黑斑病菌效果较好。

3 结论与讨论

试验结果表明，皂荚内生细菌中广泛分布着抑菌活性菌株(占分离菌株总数的50%左右)，其代谢产物对病原菌的抑制作用差异较大，表明其代谢可能产生蛋白类、抗生素类或多肽类等多种抗菌物质。筛选出的潜在生防菌ZJ4、ZJ7经高温灭菌处理后抑菌活性明显下降，推测其可能代谢产生对热敏感的蛋白酶类，而且其对不同病原菌的抑制作用表现出一定的选择性，因此下一步将对抗菌物质特别是抗菌蛋白进行分离纯化，进一步研究抗菌机理，探索其在农作物病虫害防治中的应用途径。

表3 ZJ4和ZJ7发酵液对6种植物病原菌的抑制率

Table3 Inhibition rate of the endophytic bacteria ZJ4 and ZJ7 on six plant pathogens/%

植物病原菌Pathogens ZJ4菌株Strain ZJ4 ZJ7菌株Strain ZJ7番茄早疫病菌A. solani79.0582.58番茄灰霉病菌B. cinerea 76.6272.56梨黑斑病菌A. alternata 83.9980.63棉花立枯病菌R. solani 34.0443.19辣椒枯萎病菌F. oxysporum f.sp. capsicum 37.00 48.25西瓜枯萎病菌F. oxysporum f.sp. niveum- -

注：“-”代表无抑菌作用。

Note： "-"denote not inhibition.

内生菌生活于植物的根、茎、叶等组织器官中，一旦从寄主植物中分离出来后，由于生存环境的变化，某些特性可能会改变，菌种也容易出现退化、变异等现象[11]。因此，对初步筛选出来的菌株还需进一步测定其生物学及生理生化特性，以确定其最适的培养和保存条件。

参 考 文 献

[1]林玲,乔勇升,顾本康,等.植物内生细菌及其生物防治植物病害的研究进展[J].江苏农业学报,2008,24(6):969-974.

[2]韩继刚,宋未.植物内生细菌研究进展及其应用潜力[J].自然科学进展,2004,14(4):16-21.

[3]Range shwaran R,WasnikarA R,PrasadR D.Isolation of endophytic bacteria for biological control of wilt pathogen[J].Journal of Biological Control,2002,16(2):125-133.

[4]崔林,孙振,袁军,等.马铃薯内生细菌的分离及环腐病拮抗菌的筛选鉴定[J].植物病理学报,2003,33(4):353-358.

[5]李进荣,段玉玺,陈立杰,等.大豆根瘤内生细菌对大豆胞囊线虫影响研究[J].大豆科学,2005,24(2):154-156.

[6]梁静谊.皂荚荚果化学组成及皂甙提取工艺的研究[D].南京:南京林业大学,2004.

[7]张玉洁,李洪超.三七内生菌分离及抗根腐病病原真菌筛选[J].北方园艺,2011(23):130-132.

[8]冀玉良,李丹青,李堆淑,等.连翘内生菌的分离及对植物病原菌的抑菌活性测定[J].西南农业学报,2011,24(6):2258-2262.

[9]何建清,张格杰,陈芝兰,等.大花黄牡丹内生菌的分离鉴定及其抗菌活性菌株的筛选[J].西北植物学报,2011,31(12):2539-2544.

[10]王慧利.抗真菌活性水稻内生菌的筛选及美达霉素生物合成中糖基化机制研究[D].武汉:华中师范大学生命科学学院,2010.

[11]蔡永欢.喜树内生真菌的分离及其对植物病原菌的抑菌活性研究[D].合肥:安徽农业大学,2010.