干酪乳杆菌与银杏叶提取物对肥胖小鼠血脂及抗氧化功能的影响

温 啸,贺大方,倪学勤,张 丹,丁艳东,辛金鸽，李利杰,曾 东

(四川农业大学 动物医学院 动物微生态研究中心，四川 雅安 625014)

高血脂症是当今社会常见的一种疾病，发病率在逐年上升，已被称为人类健康的三大杀手之一。高血脂除导致动脉粥样硬化，诱发冠心病、脑中风、心肌梗塞等疾病外[1]，还会诱发高血压、高血糖、脂肪肝等严重疾病，对人体健康危害严重[2]。因此，研发能够降低血脂的保健药品，对预防疾病、保护身体健康具有重要意义。然而，在高血脂症新型保健食品的开发及新药研究中，常见的降脂药物虽对血脂有较强的调节作用，但副作用也较明显，在治疗疾病的同时也会留下不少后遗症[3]，所以，研制既安全有效、又无毒副作用的降脂药物，成为当前医学研究中的一个重要课题。

研究表明，中药对益生菌的增殖有促进作用，将有益菌与中药联合应用，不仅具有无毒、无害和无污染的特点，而且还可通过相互的促进作用加强疗效[4-5]。乳酸菌作为微生态制剂，具有减少血清中的胆固醇含量、降低心血管疾病发病率，抗脂质过氧化、清除DPPH自由基和超氧阴离子自由基的功效[6]，被认为是一种具有多重降血脂作用的微生物。人体临床试验也表明，口服乳酸菌可以对总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(LDL)水平产生有益作用[7-8]。银杏叶(Ginkgobiloba)具有多种药理功能[9]，其有效活性成分主要是银杏萜内酯类化合物和黄酮类化合物，是天然的自由基清除剂，具有抗氧化以及改善缺血心肌功能等生理功效[10]。银杏叶提取物(EGb)具有降低SD大鼠血清中胆固醇含量的作用[11]。由以上研究结果可知，乳酸菌和银杏叶提取物均具有降低血脂的作用，但是有关两者的比较及联合作用的研究尚未见报道。为此，本研究拟通过建立小鼠高脂血症模型，研究乳酸菌、银杏叶提取物及二者混合液对高脂血症小鼠的降血脂及抗氧化效果，以期为生物降血脂疗法的研究与应用提供新的思路，为开发安全、无毒副作用的降脂药品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

银杏叶提取物(EGb，含质量分数24%黄酮苷和6%银杏内酯)购于四川同泰植物化工有限公司；干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)干酪亚种K1，由四川农业大学微生态实验室提供；雌性小鼠60只，由四川农业大学龙鼠家园提供，体质量(20±1.0) g/只；MRS培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏粉4 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 mL，磷酸氢二钾2 g，乙酸钠5 g，柠檬酸三铵0.2 g，磷酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)检测试剂盒，购自南京建成生物研究所。

1.2 仪 器

全自动生化分析仪GS200，深圳市锦瑞电子有限公司产品；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；酶标仪WD-2102A，北京市六一仪器厂产品。

1.3 方 法

1.3.1 干酪乳杆菌菌液的制备 将干酪乳杆菌K1菌株涂布于MRS固体培养基上，37 ℃静置培养24 h。挑取单一菌落接种于MRS液体培养基，37 ℃培养32～36 h后备用。

在无菌条件下，取1 mL培养后的干酪乳杆菌菌液加入装有99 mL无菌生理盐水的锥形瓶中，用漩涡振荡器振荡10 min，使试样混合均匀，即成 10-2稀释液，然后无菌条件下10倍稀释，分别从10-5，10-6和10-73个稀释度试管中取0.1 mL稀释液，涂布接种于MRS琼脂平板上，每个稀释度做3个重复。37 ℃厌氧培养至长出菌落后进行计数。在灌胃前，样品均以PBS溶液制成108CFU/mL的悬液，临用时新鲜配制。

1.3.2 银杏叶提取物溶液的配制 将银杏叶提取物加温(37 ℃)配成质量浓度为41.7 mg/mL的银杏叶提取物溶液，因银杏叶提取物中黄酮苷的质量分数为24%，换算可知银杏叶提取物溶液中黄酮苷的质量浓度约为10 mg/mL。本试验中若以每千克体质量100 mg的黄酮苷量灌胃小鼠，则每只小鼠((20±1.0) g)约需灌胃银杏叶提取物溶液0.2 mL[12]。

1.3.3 高脂饲料的制备 在基础饲料[13]的基础上，参照文献[11]的方法改良配制高脂饲料。高脂饲料配方(质量分数)为：胆固醇2%，胆酸钠0.5%，丙硫氧嘧啶0.2%，蔗糖5%，猪油10%，基础饲料82.3%。

1.3.4 试验分组及血清样品的制备 将60只健康雌性小鼠饲养在干燥、清洁、通风良好的环境中，温度控制在(24±1) ℃，预饲1周基础饲料后，将小鼠随机分成5组，每组12只，试验1组为空白对照组，饲喂基础饲料并灌胃0.2 mL/(只·d) PBS缓冲液；试验2组为高脂对照组，饲喂高脂饲料并灌胃0.2 mL/(只·d) PBS缓冲液；试验3组为干酪乳杆菌组，饲喂高脂饲料并灌胃0.2 mL/(只·d)干酪乳杆菌菌液；试验4组为银杏叶提取物组，饲喂高脂饲料并灌胃0.2 mL/(只·d)银杏叶提取物溶液；试验5组为干酪乳杆菌与银杏叶提取物混合组(以下简称为混合组)，饲喂高脂饲料并灌胃0.1 mL/(只·d) 银杏叶提取物溶液和0.1 mL/(只·d)干酪乳杆菌菌液。

将各组小鼠分笼饲养，自由进食饮水。饲喂30 d后各组随机选择10只小鼠称体质量。禁食10 h后，用乙醚麻醉，从眼眶采血0.5 mL。室温下静置30 min，3 500 r/min离心10 min，分离血清备用。

1.3.5 指标测定 采用全自动生化分析仪GS200测定血清中的总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、谷丙转氨酶(ALT)、白蛋白(ALB)、葡萄糖(GLU)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和总蛋白(TP)浓度。按照试剂盒说明书检测丙二醛(MDA)浓度及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.4 统计分析

采用SPSS 17.0软件对试验数据进行差异显著性分析，差异显著者再采用Duncan法进行多重比较，数据结果以“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 干酪乳杆菌与银杏叶提取物对小鼠体质量及血脂浓度的影响

由表1可以看出，高脂对照组(试验2组)小鼠血清中的TG、TC浓度以及体质量与空白对照组(试验1组)相比差异极显著(P<0.01)或显著(P<0.05)，证明肥胖模型建模成功。高脂对照组、银杏叶提取物组(试验4组)和干酪乳杆菌组(试验3组)的小鼠体质量与空白对照组都存在显著性差异(P<0.05)，银杏叶提取物组的小鼠体质量与高脂对照组之间存在显著性差异(P<0.05)，空白对照组(试验1组)和混合组(试验5组)的小鼠体质量与高脂对照组之间均存在极显著差异(P<0.01)，且空白对照组的体质量与混合组基本相近。银杏叶提取物组、干酪乳杆菌组和混合组小鼠的TG水平与高脂对照组之间存在极显著性差异(P<0.01)，其中混合组的TG值与空白对照组小鼠相近。与高脂对照组相比，银杏叶提取物组、干酪乳杆菌组和混合组的TC水平均较低，但只有混合组与高脂对照组之间存在极显著差异(P<0.01)。银杏叶提取物组和混合组的HDL-C均高于高脂对照组并存在极显著性差异(P<0.01)，其中混合组的HDL-C水平最高，且极显著高于空白对照组。混合组的LDL-C水平较高脂对照组有所降低，但干酪乳杆菌组的作用效果最好。

表 1 干酪乳杆菌与银杏叶提取物对小鼠体质量及血脂浓度的影响

2.2 干酪乳杆菌与银杏叶提取物对小鼠血清生化指标的影响

由表2可以看出，虽然各组小鼠的TP和ALB浓度无明显差别，但混合组的TP浓度低于其他组，而ALB浓度高于干酪乳杆菌组和银杏叶提取物组，低于高脂对照组和空白对照组。干酪乳杆菌组的GLU浓度显著低于高脂对照组(P<0.05)，ALT浓度也低于其他各组(P>0.05)。

表 2 干酪乳杆菌与银杏叶提取物对小鼠血清生化指标的影响

2.3 干酪乳杆菌与银杏叶提取物对小鼠血清抗氧化活性的影响

由表3可见，混合组的CAT活性与高脂模型组和空白对照组之间均呈极显著性差异(P<0.01)，说明干酪乳杆菌和银杏叶提取物混合可以有效降低肥胖小鼠的CAT活性。相对于高脂对照组，只有混合组的GSH-Px活性显著提高(P<0.05)，说明干酪乳杆菌与银杏叶提取物混合可以有效提高小鼠血清中GSH-Px的活性。与高脂对照组小鼠相比，混合组可以降低小鼠血清中MDA浓度，SOD活性也有所降低，接近空白对照组小鼠的SOD水平。

表 3 干酪乳杆菌与银杏叶提取物对小鼠血清中SOD、CAT、GSH-Px活性和 MDA 浓度的影响

3 讨 论

3.1 干酪乳杆菌与银杏叶提取物混合作用对小鼠体质量及血脂指标的影响

高血脂症是由于脂肪摄入过多或脂质代谢障碍等因素所引起的血浆中脂质持续升高的一种异常生化表现[14]。有资料证明，血液中TC、TG浓度与冠心病发病率有明显的正相关性，HDL-C浓度与心血管疾病的发病率、动脉粥样硬化呈负相关性[15]。且流行病学资料已表明，HDL-C浓度升高可预防动脉粥样硬化发生，转运脂质,对血管具有保护作用[16]。近几十年来的有关研究表明，改善血脂代谢紊乱可以明显降低冠心病的发病率和死亡率。

银杏叶提取物(EGb)中的黄酮类和萜内酯可改善人体心血管功能，其水提物有降血脂作用[17]。已有文献报道，EGb通过清除氧自由基和抗脂质过氧化作用而降脂[18],可有效预防和治疗高血脂症。乳酸菌作为非药物治疗的生物降血脂法，具有专一性强、反应条件温和及降解效率高等特点，乳酸菌通过同化作用、共沉淀作用、吸收作用、共沉淀与吸收的共同作用，在一定的 pH 条件下吸收胆固醇发生共同沉淀，通过胆固醇还原酶途径降低胆固醇[7]。本研究发现，与高脂对照组相比，单独使用干酪乳杆菌或银杏叶提取物均对小鼠体质量和血脂指标有调节作用，与文献报道[7,17-18]相似。但与高脂对照组相比，干酪乳杆菌与银杏叶提取物协同作用后，小鼠体质量降低13.22%，TC和TG降解率分别达到24.48%和20.93%；小鼠血清中HDL-C增加167.85%，表明干酪乳杆菌与银杏叶提取物具有协同作用，可以降低血清TC、TG的浓度，促进HDL-C的生成，减轻小鼠体质量，通过调节脂肪代谢，进而预防动脉粥样硬化的发生。

3.2 干酪乳杆菌与银杏叶提取物混合作用对小鼠血清抗氧化性的影响

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)可以减少活性氧自由基的产生，防止脂质过氧化物对机体组织造成损害[19]。超氧化物歧化酶(SOD)能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。因此，测定血清中GSH-Px和SOD的活性，可以间接反映机体清除自由基的能力。MDA是细胞膜脂质过氧化的产物，其含量高低可以反映机体内脂质过氧化的程度，测定血清中MDA含量，可以间接反映细胞受氧化损伤的程度[20]。有研究表明，EGb能直接清除超氧阴离子及氧自由基，降低血清活性氧含量、黄嘌呤氧化酶活性，并可增强GSH-Px、SOD、CAT的活性[21]。而大多数乳酸菌是通过产SOD和GSH-Px来清除羟自由基和过氧化氢的，对人体而言，乳酸菌中的一些抗氧化物质能被肠道吸收而抑制血液中低密度脂蛋白(LDL)的氧化作用[22]。本试验结果显示，与高脂对照组相比，干酪乳杆菌或银杏叶提取物单独使用都可以提高小鼠血清抗氧化作用，与文献报道结果[7,17,21]相似；而干酪乳杆菌与银杏叶提取物协同作用后，GSH-Px活性提高了13.14%，CAT和SOD活性及MDA浓度降低了49.01%，3.1%和6.0%，比单独使用干酪乳杆菌或银杏叶提取物的效果更好。这可能是由于,银杏叶提取物对干酪乳杆菌的活性产生了促进作用，或者是干酪乳杆菌代谢银杏叶提取物产生了新的活性物质，具体作用机制还有待进一步研究。

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