应用半乳糖表型差异高效筛选α-1,3半乳糖苷转移酶基因缺失的猪成纤维细胞

岳成鹤，曹随忠，李西睿，冯 冲，龙 川，余树民，储明星，潘登科

(1 四川农业大学 动物医学院，四川 雅安 625014；2 中国农业科学院 北京畜牧兽医研究所，北京 100193)

异种移植(Xenotransplantation)是解决人体组织器官移植来源短缺问题的潜在途径之一，小型猪以其多方面的优点为异种移植的发展提供了一个能够规避灵长类供体先天不足的理想供体选择[1-4]。然而，小型猪作为供体向灵长类进行异种移植时存在一系列排斥反应，其中超急性排斥反应(Hyperacute rejection，HAR)是异种移植早期发生的首要免疫障碍。HAR是由灵长类体内预存的针对供体αGal表位的天然抗体介导产生的排斥反应。供体GGTA1基因(α1,3 galactosyl transferase gene)的失活能够减少绝大部分αGal表位的产生，从而基本阻断HAR[5]。

利用同源重组(Homologous recombination，HR)制备哺乳动物基因敲除体细胞的效率非常低(10-7～10-6)[6-7]，而同源重组的鉴定通常依靠对相应抗性基因的分子生物学检测。若靶基因的缺失可导致细胞明显的表型改变，则可利用表型差异来更为高效地筛选基因缺失细胞[8-9]，而且利用表型差异能够筛选出多种因素导致的靶基因失活细胞[5]。

非灵长类动物细胞表面存在的αGal表位，主要由GGTA1基因表达产物α-1，3半乳糖苷转移酶(简称α1,3GT)产生。GGTA1基因失活将极显著地减少细胞表面的αGal表位，通过一定的方法使αGal表位表达量的差异显现出来，便可将GGTA1基因失活细胞分离开来。艰难梭菌毒素A (ClostridiumdifficileToxin A,TcdA)和植物凝集素GSI-B4(Griffonia simplicifolia-Isolectin B4)是2种能够特异性结合αGal表位的药物。利用TcdA特异性结合αGal表位的特性及其细胞毒性可以去除大量表达αGal的细胞[5]，从而使αGal表位缺失的细胞得到富集。将GSI-B4用异硫氰酸荧光素(FITC)或其他标识分子 (如生物素) 标记，可用于对αGal表位的特异性标记而获知αGal表位的存在及表达量。目前,利用TcdA和GSI-B4对αGal表位的特异性作用，多个研究组均筛选获得了GGTA1基因缺失细胞[5,7,10]。此外，磁激活细胞分选(Magnetic Activated Cell Sorting, MACS)技术应用于GGTA1-/-细胞的分选也获得了成功[10]。

本研究尝试利用MACS、MACS联合流式细胞术(Fluorescent activated cell sorting，FACS)、TcdA联合FACS等3种筛选方法，从经过GGTA1基因同源重组载体转染的GGTA1+/-五指山小型猪(Wuzhishan miniature pig，WZSP)GGTA1+/-胎儿成纤维细胞中筛选GGTA1-/-细胞，以建立稳定的GGTA1-/-细胞筛选平台，为GGTA1基因缺失五指山小型猪的制备奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 细胞和质粒 分离自GGTA1+/-五指山小型猪35 日龄再克隆胎儿的GGTA1+/-胎儿成纤维细胞系(233GKO-1-FF0、233GKO-2-FF0和233GKO-4-FF0)，启动子缺陷型同源重组载体pBS-GGTA1-SKO(携带新霉素磷酸转移酶基因，neo)及pBS-GGTA1-DKO(携带嘌呤霉素N-乙酰转移酶基因，puro)，均由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所基因与细胞工程室转基因猪研究组构建与保存。

1.1.2 主要仪器和试剂 磁力吸附架，FACS Calibur流式细胞仪、MoFlo流式细胞仪(Beckman，美国)，Nucleofector II核转染仪(Lonza)，细胞培养皿、70 μm细胞筛(BD，美国)，杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS)、胎牛血清(Gibco)，胰蛋白酶(Sigma，美国)，FITC conjugated GSI-B4、Biotin conjugated GSI-B4、Dynabeads®M-280 Streptavidin(Invitrogen，美国)，TcdA(ClostridiumdifficileToxin A，ENZO Life Science)。

1.2 GGTA1基因同源重组载体电转染GGTA1+/-胎儿成纤维细胞

取冻存的GGTA1+/-胎儿成纤维细胞233GKO-1-FF0、233GKO-2-FF0、233GKO-4-FF0，解冻后接种到T25细胞瓶中，待细胞生长至亚汇合状态时用1 g/L胰酶消化收集并计数，取106个细胞1 000 r/min离心5 min，去除上清液后用100 μL电转染液重悬细胞，向细胞悬液中加入6～8 μg线性化的同源重组载体pBS-GGTA1-SKO或pBS-GGTA1-DKO，充分混匀后小心加入电击杯中，按照Nucleofector II核转染仪程序T016进行电转染。经电转染的细胞接种至60 mm细胞培养皿，用含有体积分数20 %胎牛血清的DMEM培养液培养48 h后消化，按1∶3的比例(贴壁细胞，1皿传3皿)传代，经3～6次传代的细胞用于表型差异筛选试验。

电转染时，用线性化的同源重组载体pBS-GGTA1-SKO和pBS-GGTA1-DKO，按每100万细胞6 μg载体的比例电转染细胞系233GKO-1-FF0，所获细胞分别命名为233SKO-1-N和233DKO-1-P；相同条件电转染细胞系233GKO-2-FF0，所获细胞分别命名为233SKO-2-N和233DKO-2-P。用线性化的同源重组载体pBS-GGTA1-SKO，按每100万细胞8 μg载体的比例电转染细胞系233GKO-4-FF0，所获细胞命名为233SKO-4-N。

1.3 MACS分选和富集αGal表位缺失细胞

将1.2中所获细胞233SKO-1-N、233SKO-2-N、233DKO-1-P扩大培养，1 g/L胰酶消化、收集细胞后用DPBS洗涤后，加入0.2 mg/mL Biotin conjugated GSI-B4溶液重悬细胞(每20 μL 重悬106个细胞)，冰上孵育30 min；完成孵育的细胞用DPBS洗涤，加入Dynabeads®M-280 Streptavidin悬液充分重悬，冰上孵育30 min；经孵育的细胞-磁珠悬液置于磁力吸附架上吸附3 min，将细胞悬浮液吸入新的试管中，磁吸附过程重复3～5次。取少量完成磁吸附的细胞悬液进行细胞计数：细胞密度小于104mL-1时，取适量细胞进行克隆化培养；细胞密度大于104mL-1时，则将所有细胞收集混合扩大培养，用于流式细胞术分选。

1.4 TcdA富集αGal表位缺失细胞

将1.2中所获细胞233DKO-2-P和233SKO-4-N接种至100 mm培养皿，细胞生长至亚汇合状态时按1∶4传代，培养2 d后采用2×10-3g/L的TcdA溶液处理。去除培养液用DPBS洗涤细胞后，每个100 mm培养皿加入5 mL TcdA溶液，置于38 ℃作用2～4 h，然后去除培养皿中的液体，加入DPBS洗涤。洗涤后向细胞培养皿中加入含体积分数10%～20%胎牛血清的DMEM培养液培养，每2 d换液1次。观察培养皿中的细胞克隆状态，若每个培养皿中形成的细胞克隆少于50个，则进行单细胞克隆培养与挑取；若皿中形成的细胞克隆较多，将细胞克隆混合扩大培养，进行流式细胞术分选。

1.5 流式细胞术分选αGal表位缺失细胞

将1.3和1.4中混合扩大培养获得的细胞消化，DPBS洗涤，然后加入0.2 g/L 的FITC conjugated GSI-B4溶液重悬细胞(每20 μL重悬106个细胞)，冰上孵育30 min。完成孵育的细胞经DPBS洗涤2次后，加入少量DPBS重悬，1 h内上机进行流式细胞术分选。分选时在FSC-Pulse width和FL1-FL2同时设门筛选细胞大小合适的FITC阴性细胞群(即αGal表位缺失细胞；结果如图1所示)。流式细胞术分析时采用FL1-Counts峰图，判定依据是染色后细胞的平均相对荧光强度(FL1)，αGal表位阴性细胞FL1为80左右，αGal表位阳性细胞FL1则为200以上。

图1 αGal表位缺失细胞的流式分选设门示意图(233DKO-2-P)

1.6 细胞鉴定

经MACS筛选获得的单细胞克隆首先进行PCR鉴定，再利用FACS检测细胞αGal表位，FACS方法同1.5。MACS联合FACS获得的细胞集落和TcdA联合FACS获得的细胞集落只进行PCR鉴定。

同源重组载体pBS-GGTA1-SKO结构见图2，上、下游引物分别设计在其同源短臂和同源长臂上，跨重组第4外显子的PCR产物长度为2 005 bp。基因重组试验中，使用的同源重组载体pBS-GGTA1-DKO除抗性标记基因外，其余结构(主要是同源长臂和同源短臂)与pBS-GGTA1-SKO相同，故可使用相同的PCR鉴定引物，但PCR产物长度不同，分别为2 005 bp和1 859 bp。

图2 pBS-GGTA1-SKO载体结构

用野生型WZSP胎儿成纤维细胞作阴性对照，而跨野生型第4外显子的PCR产物长度为942 bp。GGTA1+/-细胞的跨第4外显子的PCR产物则有2个：一是长度为942 bp野生型，二是长度为2 005 bp的突变型。

用pBS-GGTA1-SKO电转染GGTA1+/-细胞，若能得到GGTA1-/-细胞，则其跨第4外显子的PCR产物均为突变型，长度为2 005 bp，在电泳图上表现为1条2 005 bp大小的亮带。

用pBS-GGTA1-DKO电转染GGTA1+/-细胞，若能得到GGTA1-/-细胞，则其跨第4外显子的PCR产物均为突变型，长度分别为2 005 bp和1 859 bp，在电泳图上表现为长度约2 005 bp和1 859 bp的2条亮带。

用于PCR鉴定的细胞裂解后提取基因组DNA进行鉴定。PCR鉴定引物设计在跨抗性标记基因的同源长臂(3′)和短臂(5′)上，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，其序列为：P1 5′-GGATGCTTCCTCTAGTCTGTGATG-3′；P2 5′-CTCTAGCCTACCCAGAACTGCAGAG-3′。PCR反应体系为：DNA模板1 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，2×TaqPCR Master Mix 10 μL，灭菌ddH2O 8 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃ 变性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物经20 g/L 琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察并拍照。

2 结果与分析

2.1 MACS法及MACS联合FACS筛选GGTA1-/-细胞

经免疫磁珠筛选和有限稀释法培养，细胞系233SKO-1-N和233SKO-2-N分别得到5个和6个细胞克隆，233DKO-1-P未获得单细胞克隆。经PCR鉴定，上述11个细胞克隆中，1N-3M和1N-4M这 2个细胞克隆的基因型为GGTA1-/-(表1和图3)，阳性率为18.2%。

1N-3M的FACS检测结果见图4。1N-3M细胞经FITC标记的GSI-B4染色后，其FL1平均相对荧光强度为80左右，而GGTA1+/-细胞及GGTA1+/+细胞染色后FL1平均相对荧光强度为200左右，这表明筛选获得的成纤维细胞克隆1N-3M αGal表位缺失(即GGTA1-/-)。

利用MACS联合FACS筛选，细胞系233SKO-1-N、233SKO-2-N和233DKO-1-P 各得到1个单细胞克隆，但经PCR鉴定这些细胞仍为GGTA1+/-细胞(表1)。233SKO-2-N获得的单细胞克隆2N-4MF经 PCR鉴定，结果显示2条电泳条带分别位于约942 bp(野生型第4外显子)和2 005 bp(含neo的突变型第4外显子)，无1 859 bp大小的条带(整合的puro)(图5泳道2)，也是GGTA1+/-细胞。

表 1 MACS及MACS联合FACS获得细胞克隆的PCR鉴定结果

图3 跨neo的细胞克隆PCR鉴定(部分结果)

图4 流式细胞术分析GGTA1-/-细胞1N-3M的αGal表达量

2.2 TcdA联合FACS筛选GGTA1-/-细胞

细胞233DKO-2-P和233SKO-4-N按1∶4比例传代后的第2天用TcdA溶液处理，处理后经10 d培养，来自233DKO-2-P和233SKO-4-N的细胞数量分别扩增至约0.9×107个和1.8×107个。上述细胞经FACS筛选获得3个细胞集落，分别是2P-1TF、4N-1TF和4N-2TF，经 PCR鉴定，这3个细胞克隆均无942 bp条带而仅有2 005 bp条带(图5，表2)，表明2P-1TF、4N-1TF和4N-2TF均为GGTA1-/-细胞，阳性率为100%。

图5 TcdA联合FACS获得细胞及2N-4MF细胞的PCR鉴定

表 2 TcdA联合FACS获得的细胞克隆基因型

3 讨 论

利用MACS筛选获得的11个细胞克隆，经PCR鉴定有2个是GGTA1-/-细胞克隆，而MACS富集后联合FACS获得的3个细胞集落经PCR鉴定均不是GGTA1-/-细胞克隆，TcdA富集后联合FACS获得的3个细胞集落经PCR鉴定均为GGTA1-/-细胞克隆。结果表明，MACS或TcdA富集联合FACS能够高效地筛选出GGTA1-/-细胞。

GGTA1基因的蛋白表达产物α1,3GT是产生异种抗原αGal表位的主要原因，敲除GGTA1基因可以基本消除αGal表位[11-13]。本研究采用的GGTA1+/-细胞是具有杂合型GGTA1基因的细胞，GGTA1等位基因中的一个第4外显子(89 bp)已经被携带neo的同源靶向DNA序列(约2 005 bp)所替代而成为突变型GGTA1基因，即该GGTA1基因已经失活[14]。由于猪是二倍体动物，GGTA1+/-细胞中具有正常活性的野生型GGTA1基因，其能够表达α1,3GT使GGTA1+/-细胞表面表达αGal表位，而GGTA1-/-细胞的αGal表位缺失，这为利用αGal表位的表型差异筛选GGTA1-/-细胞的实现提供了可能。

五指山小型猪GGTA1单等位基因敲除(GGTA1+/-)的再克隆猪胎儿成纤维细胞在基于表型缺失的筛选之前，已经过同源重组载体pBS-GGTA1-SKO(带neo标记)或同源重组载体pBS-GGTA1-DKO(带puro标记)的电转染。本试验设计与Phelps等[5]、Simonds等[15]采用的策略类似，但以下3个方面具有明显的特色：①同源重组载体的抗性标记基因改换为puro，其目的一方面是探索在GGTA1单等位基因敲除细胞基础上进一步同源重组的可能性，另一方面是试图厘清GGTA1-/-细胞产生的原因，即这些细胞来自于同源重组还是细胞内发生的杂合性缺失。结果显示，利用带puro标记的同源重组载体进行基因同源重组获得的GGTA1-/-细胞克隆(2P-1TF)只有标记基因neo，而无puro，表明细胞克隆2P-1TF发生了杂合性缺失。而Phelps等[5]研究中未更换抗性标记，Simonds等[15]未在GGTA1单等位基因敲除细胞基础上进行进一步同源重组。②使用TcdA富集GGTA1-/-细胞，而非直接获得单细胞克隆。富集之后的细胞采用流式细胞分选直接获得GGTA1-/-细胞，或者将流式细胞分选后的细胞用于有限稀释法以获取单细胞克隆，该方案使得GGTA1-/-细胞的筛选效果更加稳定，并且事实证明是可行而高效的。③筛选GGTA1-/-细胞时对MACS的使用更加灵活：当富集效率高时采用有限稀释法，而富集效率低时将富集后的细胞用于FACS。

利用同源重组载体pBS-GGTA1-SKO(带neo标记)或同源重组载体pBS-GGTA1-DKO(带puro标记)对GGTA1+/-细胞进行同源重组，这在一定程度上增加了GGTA1-/-细胞产生的概率，同时，转染时采用改换抗性标记的同源重组载体,可以使产生的GGTA1-/-细胞能通过一定的手段区别其产生原因：①如果GGTA1-/-细胞GGTA1基因的缺失来自于杂合性缺失，则该细胞中1对等位GGTA1基因中第4外显子均含neo基因；②如果GGTA1-/-细胞GGTA1基因的缺失来自于pBS-GGTA1-DKO(带puro标记)的同源重组，则该细胞1对等位GGTA1基因中第4外显子将分别含neo基因和puro基因，而此二者的标记基因可以用PCR鉴别。从细胞系233-DKO-1P筛选出的1个细胞集落2P-1TF经PCR鉴定，其GGTA1基因第4外显子只含neo基因，说明细胞集落2P-1TF中GGTA1基因的缺失原因是杂合性缺失，结果与Simonds等[15]和Fujimura等[10]的报道一致。本研究中，TcdA联合FACS获得GGTA1-/-细胞克隆的效率最高，达100%(3/3)，MACS筛选GGTA1-/-细胞克隆的效率也达到了18.2%(2/11)，高于Fujimura等[10]的报道：MACS筛选效率4.49 %(7/150)，TcdA联合FACS筛选效率1.45 %(2/134)。上述结果表明，优化的细胞表型筛选方案显著提高了GGTA1-/-细胞的筛选效率。

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