一株鸡源嗜铅乳酸菌的筛选鉴定

姜彦君等

摘要：试验目的是从肉鸡的肠道内容物及排泄物中筛选出具有铅抗性的细菌，用于重金属铅的去除。采用涂布平板技术从采集的样品中共分离筛选到8株具有较好铅抗性和吸附性的菌株，其中JT1菌株对铅的抗性（800 mg/L）和去除能力 （66.95%）最高。通过培养特征、形态观察、生理生化鉴定、16S rDNA序列分析等方法证明，所得JT1菌株为屎肠球菌（Enterococcus faecium）。该菌株可以在10～45℃、pH 4.5～9.6、6.5%NaCl溶液、0.8%胆盐、0.1%胰蛋白酶浓度条件下生长良好。

关键词：鸡；重金属；铅；乳酸菌

中图分类号：Q939.92文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）02-0072-06

由于人为因素（农业、工业及军事作业）影响，重金属对环境的污染越来越严重，近几年已逐步成为全球问题。重金属是生物体非必需元素，对植物、动物都具有毒性。由于重金属的非生物降解性和永久存在性，很容易在土壤、植物以及水生植物和动物中积累，从而导致其浓度在食物链中不断放大[1]。

在有害重金属中，铅（Pb）和镉（Cd）是最主要的污染物，可以引起多种生物有机体的功能障碍，通过食物链进入人体后，可引起各种疾病，例如镉会引起骨软化、肺癌、肾癌、心血管系统和生殖系统紊乱[2]，铅会损坏中枢神经系统、降低记忆力、影响儿童的智力发育和骨骼生长[3]。

研究显示，已有利用大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等细菌和真菌清除水体环境中重金属的报道，且效果显著[4]。迄今尚未见从环境及动物体内分离筛选具有重金属抗性乳酸菌的报道。本试验从肉鸡肠道中分离和鉴定出具有铅抗性的细菌，并对其16S rDNA序列进行了分析，为进一步将其作为金属清除益生菌添加到动物饲料或食品中奠定基础。

1材料与方法

1.1材料和仪器

培养基：MRS液体培养基：蛋白胨10 g，乙酸钠5 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，磷酸氢二钾2 g，葡萄糖20 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，柠檬酸二铵2 g，吐温-80 1 ml，蒸馏水1 000 ml，pH 5.4～5.6，115℃灭菌30 min；MRS固体培养基：MRS液体培养基中加入1.4%琼脂；改良MRS固体培养基：MRS固体培养基中加入5%碳酸钙；LB肉汤；营养琼脂。

试剂：乙酸铅（AR）；碳酸钙；Tris；EDTA；十二烷基硫酸钠；NaCl；酚/氯仿/异戊醇：（25∶24∶1）。

仪器： 电热恒温鼓风干燥箱：上海市精宏 DHG-9036A；高压蒸汽灭菌锅：鸟取三洋电机（广州）有限公司； 精密pH计：德国赛多利斯股份公司；水浴恒温振荡器：金城国胜实验仪器厂；电子分析天平：上海越平科学仪器有限公司；原子吸收分光光度计；高速冷冻离心机；PCR仪；电泳仪；凝胶成像设备。

1.2试验方法

1.2.1样品的采集于2011年从山东省日照市果庄肉鸡养殖场及青岛农业大学动物科技学院实验基地无菌采集粪便样品。菌株筛选试验在青岛农业大学食品风险分析实验室进行，以MRS固体培养基作为分离培养基。

1.2.2耐性菌株的驯化、筛选称取5.0 g新鲜样品，在无菌条件下将其放入装有适量玻璃珠和45 ml无菌生理盐水的锥形瓶中，37℃、140 r/min 振荡30 min后稀释至10-3、10-4、10-5，各吸取0.1 ml分别涂布于含有100、200、400、800 mg/L Pb2+的MRS固体平板上，37℃培养，于24、48 h时观察平板上细菌的生长状况[5]。将筛选出的耐铅菌株逐步在含更高铅浓度的培养基上接种培养，从而获得目的菌株。将获得的优势耐铅菌株在含200 mg/L Pb2+的培养基上分离纯化，最终获得单一菌株并保存（甘油管保存法）。

1.2.3菌株稳定性的测定将获得的优势菌株在含200 mg/L Pb2+的MRS固体培养基上连续传代多次，观察其对铅的耐受性是否发生变化，从而判断其稳定性[6]。

1.2.4耐性菌株的吸附铅试验将获得的优势菌株离心后的湿菌体加入10 ml含20 mg/L Pb2+的LB液体培养基中，振荡吸附后，12 000 r/min离心5 min，取上清液定容至50 ml，测定Pb2+的浓度，重复3次。以加大肠杆菌为对照，以不加菌为空白对照。

1.2.8JT1菌株生长特性研究

①生长曲线的测定：将活化好的JT1菌株按1%的接种量接入MRS液体培养基中，37℃摇床培养，每隔4 h取样一次，用分光光度计测定菌液的OD600值，用未接种的MRS液体培养基作为空白对照，以培养时间为横坐标，测定的相应OD600值为纵坐标，绘制菌株的生长曲线[10]。

②酸耐受试验：将活化好的JT1菌株按1%接种量分别接种于pH值3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、9.5的MRS液体培养基中，37℃培养18 h测定OD600，以pH值为横坐标，测定的相应OD值为纵坐标，绘制曲线。

③胆盐耐受试验：取活化后JT1的菌株0.1 ml分别接种于含0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%胆盐的MRS液体培养基中，37℃培养24 h，稀释适当的倍数后，进行涂布，观察生长状况[11]。

④消化酶耐受试验：按1%接种量接种于含0.1%（W/V）胰蛋白酶的MRS液体培养基中，以不添加胰蛋白酶的MRS培养基为对照，37℃培养，0、8 h时各取样一次，稀释适当倍数进行平板计数，计算存活率。

⑤抑菌性试验：选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌作为测试菌株，分别取100 μl菌液涂布于营养琼脂平板上，用直径为7 mm的无菌圆形滤低在JT1菌株发酵液中充分浸泡，等距离摆放于平板上，37℃倒置培养24 h，量取抑菌圈直径大小，测定菌株的抑菌性。endprint

2结果与分析

2.1耐性菌株的驯化、筛选及稳定性测定

在含不同铅浓度的MRS固体培养基中对样品进行筛选，获得耐铅能力较强的菌株，再将耐铅菌株在相同铅浓度的培养基上进行分离纯化，最终得到8株优势耐铅菌株JT1～JT8，其中JT1耐铅浓度最高，达800 mg/L。经过多次传代培养后，该8株菌株的耐铅性表现稳定，未发生显著变化，说明经过多次传代后没有基因丢失，具有较高的、稳定的重金属耐受性。

2.2耐性菌株吸附铅试验

不加菌的空白对照铅的测定值为4.000 mg/ml，JT1～JT8菌株处理后铅的测定值及吸附率见表2。由表2可以看出，与大肠杆菌相比，筛选驯化出的菌株对Pb2+具有一定的吸附效率，其中JT1吸附效率最高，为66.95%，具有一定的研究价值。

2.3JT1菌株Pb2+吸附的影响因素

2.3.1pH值由图1可知，在一定Pb2+浓度的溶液中，pH值较低时，JT1菌体对Pb2+吸附率较低，但随着pH值的升高，吸附率也升高，当pH值上升到6.5时，吸附率达到56.663%，pH值继续升高，吸附率基本保持稳定。因此，JT1菌株吸附重金属铅时的最佳pH值为6.5。

3讨论

通过形态、生理生化特征及16S rDNA序列测定[14]，鉴定本试验所筛选的鸡源耐铅细菌JT1为E. faecium。重金属抗性、去除能力、抑菌性等特性显示，E. faecium JT1菌株可耐受800 mg/L Pb2+，体外铅吸附率达66.95%，同时可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长，因此可以作为益生菌添加到饲料中，用以去除动物体内的重金属，控制重金属在动物体内的长期积累[15]，保障动物性食品的安全，从而确保人类的安全[16]。其具体吸附机理及体内吸附性能还需进一步的研究。

参考文献：

[1]Jarup L. Hazard of heavy metal contamination[J].Br. Med. Bull.，2003， 68（1）：167-182.

[2]王文仲，徐兆发.镉的肾脏毒理学[J].中国工业医学杂志，2001，14（5）：291-293.

[3]颜崇淮， 沈晓明. 中国儿童铅中毒防治研究的回顾和展望[J]. 中华预防医学杂志， 2008， 42（3）： 147-150.

[4]陈灿，王建龙. 酿酒酵母吸附重金属离子的研究进展[J].中国生物工程杂志， 2006，26（1）：69-76.

[5]段学军，闵航.一株抗镉细菌的分离鉴定及其抗性基因定位的初步研究[J].环境科学学报， 2004，24（1）：154-158.

[6]曹小红，杨亚静，鲁梅芳，等. 耐铅、铜微生物的筛选及吸附性能研究[J].环境保护科学， 2008，34（5）：15-17.

[7]HalttunenT， Salminen S， Tahvonen R. Rapid removal of lead and cadmium from water by specific lactic acid bacteria[J]. International Journal of Food Microbiology， 2007，114（1）：30-35.

[8]东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001.

[9]许光胜，王喜亮，吴涛，等.猪源粪肠球菌的分离、鉴定及应用[J].中国兽医学报， 2012，32（11）：1645-1650.

[10]罗雅，蒋代华，夏颖，等.一株耐铅细菌J3的筛选分离及其生物学特性[J].南方农业学报， 2011，42（9）：1041-1044.

[11]刘文华，任慧英，朱玮，等.一株优良乳酸菌的分离鉴定与特性研究[J].中国畜牧兽医， 2008，35（2）：152-155.

[12]Sheng P X， Ting Y， Chen J P. Biosorption of heavy metal ions （Pb， Cu and Cd） from aqueous solutions by the marine alga Sargassum sp. in single-and multiple-metal systems[J]. Industrial and Engineering Chemistry Research， 2007， 46（8）：2438-2444.

[13]赵娇， 赵蕾. 一株促生拮抗木霉菌的鉴定[J]. 山东农业科学， 2013， 45（4）： 86-89.

[14]李方正，唐亮，赵建文，等. 一株高效秸秆纤维素降解真菌的分离、鉴定及系统发育分析[J]. 山东农业科学， 2011， 7： 5-8.

[15]葛龙，李波.屎肠球菌在饲用微生态制剂中的研究与应用[J].饲料与畜牧， 2013，6：57-59.

[16]Marcussen H， Holm P E， Dalsgaard A. Food safety aspects of toxic element accumulation in fish from wastewaterfed ponds in Hanoi[J]. Trop. Med. Int. Health， 2007， 12（2）：34-39.endprint

2结果与分析

2.1耐性菌株的驯化、筛选及稳定性测定

在含不同铅浓度的MRS固体培养基中对样品进行筛选，获得耐铅能力较强的菌株，再将耐铅菌株在相同铅浓度的培养基上进行分离纯化，最终得到8株优势耐铅菌株JT1～JT8，其中JT1耐铅浓度最高，达800 mg/L。经过多次传代培养后，该8株菌株的耐铅性表现稳定，未发生显著变化，说明经过多次传代后没有基因丢失，具有较高的、稳定的重金属耐受性。

2.2耐性菌株吸附铅试验

不加菌的空白对照铅的测定值为4.000 mg/ml，JT1～JT8菌株处理后铅的测定值及吸附率见表2。由表2可以看出，与大肠杆菌相比，筛选驯化出的菌株对Pb2+具有一定的吸附效率，其中JT1吸附效率最高，为66.95%，具有一定的研究价值。

2.3JT1菌株Pb2+吸附的影响因素

2.3.1pH值由图1可知，在一定Pb2+浓度的溶液中，pH值较低时，JT1菌体对Pb2+吸附率较低，但随着pH值的升高，吸附率也升高，当pH值上升到6.5时，吸附率达到56.663%，pH值继续升高，吸附率基本保持稳定。因此，JT1菌株吸附重金属铅时的最佳pH值为6.5。

3讨论

通过形态、生理生化特征及16S rDNA序列测定[14]，鉴定本试验所筛选的鸡源耐铅细菌JT1为E. faecium。重金属抗性、去除能力、抑菌性等特性显示，E. faecium JT1菌株可耐受800 mg/L Pb2+，体外铅吸附率达66.95%，同时可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长，因此可以作为益生菌添加到饲料中，用以去除动物体内的重金属，控制重金属在动物体内的长期积累[15]，保障动物性食品的安全，从而确保人类的安全[16]。其具体吸附机理及体内吸附性能还需进一步的研究。

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2结果与分析

2.1耐性菌株的驯化、筛选及稳定性测定

在含不同铅浓度的MRS固体培养基中对样品进行筛选，获得耐铅能力较强的菌株，再将耐铅菌株在相同铅浓度的培养基上进行分离纯化，最终得到8株优势耐铅菌株JT1～JT8，其中JT1耐铅浓度最高，达800 mg/L。经过多次传代培养后，该8株菌株的耐铅性表现稳定，未发生显著变化，说明经过多次传代后没有基因丢失，具有较高的、稳定的重金属耐受性。

2.2耐性菌株吸附铅试验

不加菌的空白对照铅的测定值为4.000 mg/ml，JT1～JT8菌株处理后铅的测定值及吸附率见表2。由表2可以看出，与大肠杆菌相比，筛选驯化出的菌株对Pb2+具有一定的吸附效率，其中JT1吸附效率最高，为66.95%，具有一定的研究价值。

2.3JT1菌株Pb2+吸附的影响因素

2.3.1pH值由图1可知，在一定Pb2+浓度的溶液中，pH值较低时，JT1菌体对Pb2+吸附率较低，但随着pH值的升高，吸附率也升高，当pH值上升到6.5时，吸附率达到56.663%，pH值继续升高，吸附率基本保持稳定。因此，JT1菌株吸附重金属铅时的最佳pH值为6.5。

3讨论

通过形态、生理生化特征及16S rDNA序列测定[14]，鉴定本试验所筛选的鸡源耐铅细菌JT1为E. faecium。重金属抗性、去除能力、抑菌性等特性显示，E. faecium JT1菌株可耐受800 mg/L Pb2+，体外铅吸附率达66.95%，同时可以抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的生长，因此可以作为益生菌添加到饲料中，用以去除动物体内的重金属，控制重金属在动物体内的长期积累[15]，保障动物性食品的安全，从而确保人类的安全[16]。其具体吸附机理及体内吸附性能还需进一步的研究。

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[13]赵娇， 赵蕾. 一株促生拮抗木霉菌的鉴定[J]. 山东农业科学， 2013， 45（4）： 86-89.

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[16]Marcussen H， Holm P E， Dalsgaard A. Food safety aspects of toxic element accumulation in fish from wastewaterfed ponds in Hanoi[J]. Trop. Med. Int. Health， 2007， 12（2）：34-39.endprint