MCI前处理-UPLC法测定西洋参茎叶中7种人参皂苷含量

逄世峰，孙成贺，李亚丽，赵景辉，王英平

(中国农业科学院特产研究所，长春130112)

西洋参茎、叶为五加科人参属植物西洋参(PanaxquinquefoliumL.)的地上部分，亦具有多种药理活性[1，2]，人参皂苷为其中主要化学成分[3]。目前西洋参茎、叶中人参单体皂苷的测定主要采用高效液相色谱法[4，5]，此法分析时间较长，而且茎、叶中叶绿素对色谱柱污染严重。MCI凝胶柱是小孔树脂凝胶柱(聚苯乙烯基的反相树脂填料)，是在三菱化学Diaion和Sepabeads大孔吸附树脂基础上设计的，去除色素效果较好。超高效液相色谱(UPLC)为目前被证实最高效的分离仪器，在中药领域得到广泛应用[6]。本试验建立一种MCI前处理-UPLC法测定西洋参茎、叶中7种人参皂苷含量的快速检测方法，旨在为西洋参茎、叶中人参皂苷含量测定和质量控制提供参考依据。

1 仪器、试剂和材料

1.1 仪器

超高效液相色谱仪(ACQUITY UPLC，waters公司)；HH-6型数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)；电子分析天平(sartorius CPA225D型)；

1.2 试剂

乙腈为色谱纯(fisher公司)，水为超纯水。

1.3 材料

人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd(购自中国药品生物制品检定所)；西洋参采自吉林省和龙市，经中国农业科学院特产研究所许世泉副研究员鉴定为五加科植物西洋参茎、叶。

2 方法与结果

2.1 混合对照品溶液制备

精密称取7种人参皂苷标准品适量，配置成人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd含量分别为0.334mg/mL、0.756mg/mL、0.649mg/mL、0.217mg/mL、0.221mg/mL、0.424mg/mL、0.43mg/mL的混合对照品溶液。

2.2 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)，流动相乙腈-水(梯度洗脱：0min～3min，17%～19%乙腈；3min～4min，19%～21%乙腈；4min～5min，21%～26%乙腈；5min～9min，26%～27%乙腈；9min～12min，27%～32%乙腈；12min～15min，32%～43%乙腈)[3]，流速0.5mL/min，检测波长为203nm，柱温35℃，进样量2μL。

A.样品；B.标准品；1.人参皂苷Rg1；2.人参皂苷Re；3.人参皂苷Rb1；4.人参皂苷Rc；5.人参皂苷Rb2；6.人参皂苷Rb3；7.人参皂苷Rd。

2.3 线性关系

将混合对照品溶液分别用甲醇稀释1倍、1.5倍、2倍、4倍、50倍，制成一系列浓度的混合标准品溶液，在上述色谱条件下，注入超高效液相色谱仪。以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标绘制标准曲线，回归方程分别为：Rg1：Y=497 000X-2 380(r=0.999 5)，Re：Y=651 000X-5 240(r=0.999 5)，Rb1：Y=482 000X-4 150(r=0.999 5)，Rc：Y=546 000X-2 540(r=0.999 3)，Rb2：Y=573 000X-2 170(r=0.999 4)，Rb3：Y=505 000X-3 630(r=0.999 3)，Rd：Y=433 000X-2 780(r=0.999 5)。人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd线性范围分别为0.006 7mg/mL～0.334mg/mL，0.015 1mg/mL～0.756mg/mL，0.013 0mg/mL～0.649mg/mL，0.004 3mg/mL～0.217mg/mL，0.004 4mg/mL～0.221mg/mL，0.008 5mg/mL～0.424mg/mL，0.008 6mg/mL～0.43 mg/mL。

2.4 供试品溶液的制备

取西洋参茎、叶洗净，经50℃烘干，粉碎(过60目筛)，取西洋参茎、叶粉末0.1g，精密称定，置10mL容量瓶中，加入色谱纯甲醇8mL，浸泡过夜，超声提取2次，每次20min，定容摇匀，取上清液1mL，加入4mL水，全部转移至MCI小柱(直径：1.5cm，高度：2.0cm)，弃去洗脱液，再用3mL甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，定容至1mL，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，在上述色谱条件下连续进样6次，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd色谱峰面积的RSD(n=6)分别为0.18%、0.20%、0.32%、0.67%、0.16%、0.77%、0.17%。结果表明，仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，分别于0h、12h、24h、36h、48h进样测定1次，人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd色谱峰面积的RSD(n=6)分别为1.03%、0.47%、3.37%、0.96%、0.85%、0.34%、0.79%。结果表明，样品在48h内稳定。

2.7 重复性试验

取同一份样品，制备6份供试品溶液，得人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd平均含量的RSD分别为1.76%、0.87%、3.93%、1.15%、1.07%、1.11%、1.46%。结果表明，方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的西洋参茎、叶粉末，精密称定，添加一定量的人参皂苷对照品，按“2.4”项下制备供试品溶液，在上述色谱条件下测定，结果见表1。

表1加样回收率

Table 1 Sample recovery rate (n=6)

2.9 样品含量测定

取3份西洋参茎、叶样品，分别按“2.4”项下方法制备供试品溶液6份，在上述色谱条件下测定，结果见表2。

表2西洋参茎、叶7种人参皂苷含量(mg/g)

Table2contentofsevenGinsenosidesinLeavesandStemsofPanaxquinguefoliumL.

Rg1ReRb1RcRb2Rb3Rd13.518.870.582.156.8622.777.8724.018.480.571.995.1418.848.9031.746.310.642.495.8722.809.00

3 讨论

本试验中，样品前处理过程采用MCI小柱发现，MCI去除叶绿素效果明显，经处理后样品几近无色，同时考察了洗脱液体积，发现3mL甲醇即可将样品中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd洗脱完全，回收率分别为97.04%、98.96%、97.99%、97.28%、99.27%、98.83%、97.53%。超高效液相色谱为目前最高效的色谱分析仪器，尚未见在西洋参茎、叶成分分析中得到应用。本试验建立了一种测定西洋参茎、叶中7种人参皂苷含量的快速测定方法，仅在13min内完成测定，该方法具有良好的精密度、稳定性、重复性，可用于西洋参茎、叶中人参皂苷含量的测定及质量控制。

[1]杨世杰,李红,张文杰,等.西洋参茎叶皂苷对培养大鼠心肌细胞钙通道阻断作用的初步观察[J].中国药学杂志,1994,29(9):525-527.

[2]陈霞,杨世杰,陈立,等.西洋参茎叶皂苷及单体对心脏的作用[J].中国中药杂志,1994,19(10):617-620.

[3]赵立春,何颖,张晶,等.西洋参茎叶组分分析及含量测定[J].环球中医药,2009,2(4):314-315.

[4]尹尚军,吴鸿雁,徐芳菲,等.RP-HPLC法测定西洋参茎叶中二醇皂苷5种成分含量[J].第三军医大学学报,2010,32(7):658-660.

[5]许传莲,郑毅男,崔淑玉,等.RP-HPLC法测定西洋参茎叶中6种人参皂苷的含量[J].吉林农业大学学报,2002,24(3):50-52.

[6]金高娃,章飞芳,薛兴亚.超高效液相色谱在复杂体系中药分离分析中的应用[J].世界科学技术,2006,8(3):106-110.