曲普瑞林对子宫肌瘤组织中Ki67、MMP2表达的影响

王 茜 朱 军

浙江省温岭市第一人民医院药剂科，浙江温岭317500

曲普瑞林对子宫肌瘤组织中Ki67、MMP2表达的影响

王 茜 朱 军

浙江省温岭市第一人民医院药剂科，浙江温岭317500

目的探讨曲普瑞林对子宫肌瘤组织中Ki67基因、MMP2基因表达的影响。方法选择2011年5月～2013年8月温岭市第一人民医院就诊的66例子宫肌瘤患者，将其分为对照组（30例）和治疗组（36例），治疗组患者使用曲普瑞林3.75mg/次进行肌内注射，每4周给药1次，连续3个月为1个疗程；对照组患者入院后不服用任何药物，直接手术，术中均取瘤体及内膜。用免疫组化SP法检测子宫肌瘤及内膜组织中Ki67、MMP2基因的表达水平。结果治疗组子宫肌瘤Ki67、MMP2的阳性表达率（38.9%、41.7%）明显低于对照组（76.7%、70.0%），差异均有统计学意义（P＜0.01、P＜0.05）；但治疗组子宫内膜组织中Ki67、MMP2的阳性表达率（72.2%、47.2%）与对照组（80.0%、53.3%）比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论曲普瑞林能下调子宫肌瘤细胞Ki67、MMP2基因的表达，抑制肌瘤细胞的增殖和侵袭转移，这可能是曲普瑞林治疗子宫肌瘤的作用机制。

曲普瑞林；Ki67；MMP2；子宫肌瘤

子宫肌瘤是常见的良性肿瘤，在育龄期妇女中发病率较高，是导致子宫切除的首要因素[1]。当今，临床也使用药物（米非司酮、曲普瑞林）治疗子宫肌瘤。米非司酮属于合成类固醇药物，抑制下丘脑-垂体-性腺轴，具有较强的糖皮质激素、孕激素拮抗作用，能减少动脉血流，从而抑制子宫肌瘤生长，还可诱发闭经。近年来研究表明，米非司酮具有较好的临床治疗子宫肌瘤的效果[2-4]。曲普瑞林是另一个治疗子宫肌瘤的临床常用合成药物，它是促性腺激素释放激素（GnRH）十肽的类似物，能使促性激素分泌减少，雌激素水平降低，最终减小子宫肌瘤体积达到治疗的目的[5]。Ki67是增殖细胞核抗原，是可靠而全面的反应细胞群体增殖活性的客观指标，基质金属蛋白酶2（maixmetalloproteinases 2，MMP2）可降解细胞外基质，促进新生血管的形成，促进肿瘤的侵袭和转移[6]。许多研究表明，子宫肌瘤患者标本中细胞有丝分裂水平明显上调，王凤莲等[7]对46例子宫肌瘤标本研究发现，Ki67阳性表达率高达78.3%（36/46），结果说明Ki67在子宫肌瘤发生发展中发挥了一定作用。还有文献报道显示，肿瘤坏死因子α（TNF-α）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）在子宫内膜中异常分泌，可能促进子宫腺肌病的发生，而醋酸曲普瑞林可以直接作用于内膜细胞，通过阻碍血管生成的方式治疗子宫腺肌病，抑制子宫内膜的异位种植[8]。为进一步探讨曲普瑞林治疗子宫肌瘤的机制，本研究观察曲普瑞林用药后对子宫肌瘤组织中细胞核增殖抗原Ki-67、肿瘤侵袭转移促进因子MMP2表达的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2011年5月～2013年8月温岭市第一人民医院经B超和妇科检查确诊为子宫肌瘤的患者，子宫大小如孕6周至孕3个月，子宫肌瘤大小3～10 cm，治疗组为自愿接受曲普瑞林治疗者，治疗组36例，年龄21～44岁，平均（34.2±3.5）岁；子宫肌瘤大小为（6.04± 2.21）cm；增生期25例，分泌期11例；其中继发轻度贫血4例，中度贫血4例，重度贫血3例，排除血液病及内科疾病引起的贫血。对照组为同期的子宫肌瘤患者，共30例，年龄28～45岁，平均（38.3±3.1）岁；子宫肌瘤大小为（6.15±2.32）cm；增生期22例，分泌期8例。两组患者都处于生育期，排除绝经期子宫肌瘤、子宫内膜异位症及卵巢肿瘤、子宫肌瘤合并腺肌症的患者，近6个月无中药或激素类药使用史。两组年龄、子宫肌瘤大小、病理分期等比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。两组患者手术时留取肌瘤和内膜标本，所有标本均经10%中性福尔马林液固定，常规脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，并均经HE染色后确认病理诊断，临床资料完整。

1.2 试剂和方法

1.2.1 主要试剂与仪器曲普瑞林（商品名：达菲林，法国博福益普生制药公司产品，进口药品注册证号：H20090274）；兔抗人Ki67抗体均购自武汉博士德生物工程有限公司；鼠抗人MMP-2抗体购自上海太阳生物技术有限公司；免疫组化试剂盒和DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；光学显微镜为日本Olympus公司的BX-51；照相系统为日本Olympus公司的DP-12；冰箱均为日本SANYO公司。

1.2.2 治疗方法治疗组在月经来潮第5天，肌内注射第一针3.75 mg曲普瑞林，共用3次，每28天注射1次，末次注射后5～6周手术。对照组不接受药物治疗，直接进行手术。

1.2.3 免疫组化及结果判定采用SP法二步操作，具体实验步骤：固定后石蜡包埋切片，脱蜡，PBS漂洗3次，抗原修复液中修复，PBS漂洗3次，之后按照北京中杉金桥生物技术有限公司的SP法二抗试剂盒标准步骤进行，一抗4℃冰箱孵育过夜，二抗室温孵育过后，按照DAB试剂盒的标准步骤进行操作，并用84消毒液将DAB液解毒，苏木精复染，1%氨水返蓝，1%盐酸酒精分化，脱水，封片，晾干后显微镜下观察。用PBS替代一抗作为阴性对照。采用双盲法观察阳性反应。以细胞被染成黄色或棕色为阳性细胞，随机选择6个高倍视野，每个视野计数400个细胞，计算阳性细胞数所占的百分比均值，当此均值＞10%即为阳性表达[9]。

1.3 统计学方法

用SPSS 17.0统计软件进行相关统计学处理，计数资料组间比较采用χ2检验，计量资料以均数±标准差（±s）表示，采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

治疗组肌瘤组织Ki67阳性率显著低于对照组，差异有高度统计学意义（χ2=9.481，P＜0.01）；治疗组中肌瘤组织MMP2阳性率显著低于对照组，差异有统计学意义（χ2=5.298，P＜0.05）。但是在曲普瑞林处理后，子宫内膜组织中Ki67、MMP2的表达没有显著变化，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结果见表1。Ki67、MMP2在子宫肌瘤治疗组及对照组中的免疫组化蛋白表达情况依次如图1、2所示。

表1 两组Ki67、MMP2抗原检测阳性结果比较[n（%）]

3 讨论

子宫肌瘤是女性人群中最常见的良性肿瘤，多见于30～50岁年龄段，其中40～50岁发病率高达50%～60%，近年来发病率呈上升趋势。子宫肌瘤生长缓慢，恶变发生率低，临床常造成患者腹痛、感染、压迫症状、异常贫血、阴道出血、不孕等，影响广大女性的身体健康，其病因及发病机制目前仍然不是十分明确。子宫肌瘤以往的常规治疗方法是切除为主，对患者造成身心伤害，许多育龄患者很难接受。目前认为子宫肌瘤的发生发展可能与遗传，癌基因，抑癌基因，生长因子，卵巢内分泌功能，细胞凋亡，雌、孕激素及肌瘤组织中雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR），细胞免疫等有关；近年来许多研究表明，子宫肌瘤的发生发展与PR、ER关系相当密切，雌、孕激素的促有丝分裂功能是有某些特定的生长因子所介导。子宫肌瘤属于激素依赖性疾病，在肌瘤的生长过程中，雌、孕激素起到重要的促进作用[5]，王立群等[10]研究表明，子宫肌瘤细胞中ER、PR、胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）的表达明显高于子宫肌层细胞的表达，子宫肌瘤的生长与子宫肌瘤组织ER、PR、IGF-1R的表达增强有关。因此，能减少性激素的分泌就能抑制子宫肌瘤的生长；降低体内性激素水平，既抑制肌瘤细胞生长且又不降低患者生活质量是药物治疗子宫肌瘤的目的[11]。

图1 两组Ki67的细胞核表达情况比较

图2 两组MMP2的细胞浆表达情况比较

近年来，但随着医学发展及患者的需求，逐渐向保留子宫采取微创的方向发展，但药物治疗也不可忽视。子宫肌瘤药物治疗越来越受到重视，目前治疗子宫肌瘤的药物主要有促性腺激素释放激素激动剂、雄激素及中药桂枝茯苓胶囊，前两者副作用严重，中药疗效有限且月经量较多。GnRH-a是治疗子宫肌瘤有效的药物，现已得到广泛承认，术前应用可使肌瘤体积缩小，还可控制出血，提升手术的安全性[12]。陈鸽等[13]探讨米非司酮治疗子宫肌瘤的临床效果，治疗后子宫及子宫肌瘤的体积均明显缩小；促黄体生成激素（LH）、雌激素、卵泡刺激素（FSH）、孕酮水平与用药前比较显著下降，结果表明米非司酮治疗子宫肌瘤效果好，不良反应少，有积极的临床价值。张蕾等[14]研究表明，采用米非司酮治疗后子宫肌瘤体积、血红蛋白含量、月经期月经量与治疗前比较，差异均有统计学意义，米非司酮治疗子宫肌瘤方法简单，副作用小，疗效确切，具有较好的临床应用价值，尤其适用于希望保留子宫及具有生育能力的中青年女性。辛华等[15]观察子宫肌瘤患者服用米非司酮治疗后，血清IL-6和TNF-α浓度的改变，探讨米非司酮对子宫肌瘤患者的治疗作用；结果表明，子宫肌瘤患者血清IL-6和TNF-α水平总体高于正常人，经米非司酮治疗后，血清IL-6和TNF-α均降低，米非司酮是一种安全、有效的治疗子宫肌瘤的药物。曲普瑞林临床使用最常见的副作用是低雌激素症状，长期应用还可能导致骨钙丢失[16]。曲普瑞林属于GnRH-a类药物，用药后雌、孕激素水平均显著下降；还间接减少组织中ER、PR的数量，阻断激素的作用。研究表明，曲普瑞林治疗子宫肌瘤后肌瘤体积变小，经超声多普勒检测还发现，子宫血管阻力增加50%[11]。吕华等[17]和吴蕾等[11]研究表明，用曲普瑞林治疗子宫肌瘤后，肌瘤组织中的ER、PR表达显著下调，结果证明ER、PR的表达水平下降也是GnRH-a类药物治疗子宫肌瘤的机制之一。

GnRH-a类药物通过下调垂体的调节作用，使卵巢分泌雌激素减少及血清雌二醇水平下降，引起闭经，使子宫和子宫肌瘤体积缩小，从而缓解子宫肌瘤的相关症状，并改善贫血等[12]。子宫肌瘤的缩小，主要是由于肌细胞萎缩、肌丝减少；此外还可能与肌瘤组织中激素受体和细胞因子减少、血管密度减少等有关[18]，曲普瑞林造成碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子、血小板源性生长因子等多种细胞生长因子表达水平下降在治疗子宫肌瘤疗效机制中起一定作用[19-21]。研究表明应用曲普瑞林后子宫肌瘤缩小，不仅与曲普瑞林所致的低雌、孕激素血症和肌瘤内ER、PR减少有关，还与曲普瑞林导致的bcl-2/bax比值降低及凋亡调节因子降低促进细胞凋亡有关[22-24]；关红琼[1]研究发现，米非司酮用药后子宫肌瘤组织中Ki67阳性率显著低于未用药对照组，本研究用曲普瑞林治疗子宫肌瘤，可显著下调细胞增殖抗原Ki67的阳性表达率（P＜0.01），表明曲普瑞林抑制子宫肌瘤细胞增殖，这可能是曲普瑞林治疗子宫肌瘤的作用机制。此外，本文还研究了曲普瑞林治疗子宫肌瘤与肿瘤侵袭转移促进因子MMP2的表达关系，结果表明，MMP2在子宫肌瘤组织中的阳性表达率也明显下降（P＜0.05），说明曲普瑞林可能对子宫肌瘤细胞的侵袭与转移具有一定的作用。本研究同时检测了子宫内膜组织Ki67、MMP2的阳性表达率，但是与未用药对照组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。GnRH-α类药物曲普瑞林治疗子宫肌瘤，该药物通过增加释放促性腺激素的方式，间接实现临床应用，改善临床症状。

综上所述，曲普瑞林通过抑制子宫肌瘤组织Ki67、MMP2基因的表达可降低人子宫肌瘤细胞的增殖和侵袭转移能力。当然，曲普瑞林治疗子宫肌瘤的机制研究还需要进一步通过大量的临床试验进行验证，以加深对曲普瑞林治疗子宫肌瘤机制的认识。

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Effects of Triptorelin on expression of gene Ki67 and MMP2 in tissues of hysterom yoma

WANG Xi ZHU Jun
Department of Pharmacy,the First People's Hospital ofWenling City,Zhejiang Province,Wenling 317500,China

Ob jective To investigate the effects of Triptorelin on expression of Ki67 and MMP2 in tissues of hysteromyoma and endometrium.M ethods 66 cases of patientswith uterinemyoma admitted to the First People's Hospital ofWenling City from May 2011 to August 2013 were divided into the control group(30 cases)and the treatment group (36 cases),the treatment group was treated with Triptorelin 3.75 mg every time for intramuscular injection once each four weeks,1 course was 3 consecutivemonths.The control group was operated directly.Ki67 and MMP2 protein expression levels were determined by immunohistochemical technology.Results The positive rates of Ki67,MMP2 expressions of hysteromyoma in treatment group(38.9%,41.7%)were lower than those of control group(76.7%,70.0%), the differencewas statistically significant(P＜0.01,P＜0.05).However,the differences of Ki67,MMP2 expressions of endometrium were not statistically significant between the treatment group(72.2%,47.2%)and the control group (80.0%,53.3%)(P＞0.05).Conclusion Triptorelin can down-regulate the expression of Ki67 and MMP2 genes,which may offer an effective treatment option for women with uterine leiomyoma by inhibiting the proliferation and invasion in uterine leiomyoma smoothmuscle.Thismay be themechanism of Triptorelin in the treatment of hysteromyoma.

Triptorelin;Ki67;MMP2;Hysteromyoma

R737.33

A

1673-7210（2014）09（c）-0067-04

2014-04-24本文编辑：张瑜杰）

浙江省科学技术厅省级重点科技创新团队项目（编号2012R10042-15）。