外源性硫化氢对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢及护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体表达的影响

欧 琼 黄余良 张群锋

南华大学附属第二医院妇产科，湖南衡阳421001

外源性硫化氢对去卵巢骨质疏松大鼠骨代谢及护骨素/细胞核因子κB受体活化因子配体表达的影响

欧 琼 黄余良 张群锋

南华大学附属第二医院妇产科，湖南衡阳421001

目的探讨外源性硫化氢（H2S）对去卵巢骨质疏松（OP）大鼠骨代谢及护骨素（OPG）和细胞核因子κB受体活化因子配体（RANKL）表达的影响。方法将50只健康SD雌性大鼠随机分为对照组、去卵巢OP模型组和外源性H2S供体硫氢化钠（NaHS）（10、50、100μmol/kg）组，每组10只。12周后检测各组大鼠的尿钙和尿脱氧吡啶啉（Dpd）及血清钙、磷、碱性磷酸酶（ALP）和雌二醇（E2）水平，采用双能X线吸收法测量大鼠右侧股骨的骨密度（BMD），采用Western blot检测股骨中OPG和RANKL的表达。结果与对照组比较，去卵巢OP模型组大鼠血清E2[（76.83±8.12）pmol/L比（11.05±1.42）pmol/L，t=5.74，P＜0.05]和BMD水平[（0.25±0.03）g/cm2比（0.14±0.01）g/cm2，t=3.85，P＜0.05]显著降低，尿钙[（0.85±0.08）mg/L比（1.88±0.21）mg/L，t=4.65，P＜0.05]、尿Dpd[（14.67±1.28）nmol/mmol比（22.34±1.75）nmol/mmol，t=3.81，P＜0.05]、血清钙[（3.29±0.27）mmol/L比（4.68±0.52）mmol/L，t=3.98，P＜0.05]、血清磷[（2.49±0.35）mmol/L比（4.03±0.59）mmol/L，t=4.31，P＜0.05]和ALP水平[（78.65±5.23）U/L比（167.35±1.75）U/L，t=4.47，P＜0.05]均显著升高；OPG的表达显著降低[（0.68±0.09）比（0.27±0.04），t=3.82，P＜0.05]，而RANKL的表达显著增加[（0.18±0.02）比（0.66±0.09），t=3.91，P＜0.05]。与去卵巢OP模型组比较，NaHS（50、100μmol/kg）组大鼠股骨的BMD显著增加[（0.14±0.01）g/cm2比（0.19±0.02）g/cm2和（0.23±0.03）g/cm2，F=6.42，P＜0.05]，尿钙[（1.88± 0.21）mg/L比（1.39±0.09）mg/L和（0.97±0.09）mg/L，F=4.67，P＜0.05]、尿Dpd[（22.34±1.75）nmol/mmol比（18.43± 2.04）nmol/mmol和（15.75±1.14）nmol/mmol，F=3.92，P＜0.05]、血清钙[（4.68±0.52）mmol/L比（3.98±0.47）mmol/L和（3.56±0.25）mmol/L，F=3.89，P＜0.05]、血清磷[（4.03±0.59）mmol/L比（3.11±0.42）mmol/L和（2.68±0.26）mmol/L，F= 4.23，P＜0.05]和ALP水平[（167.35±1.75）U/L比（115.69±8.72）U/L和（87.61±9.56）U/L，F=4.15，P＜0.05]显著降低，OPG的表达显著增加[（0.27±0.04）比（0.48±0.05）和（0.64±0.08），F=4.84，P＜0.05]，而RANKL的表达显著降低[（0.66±0.09）比（0.37±0.05）和（0.22±0.04），F=5.16，P＜0.05]。结论外源性H2S抑制了卵巢切除所引起的OP，其作用机制可能与H2S上调骨组织中OPG的表达而降低RANKL的表达有关。

硫化氢；去卵巢；骨质疏松；护骨素；细胞核因子кB受体活化因子配体

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是一种代谢性骨骼疾病，以骨量减少、骨质丢失、骨微观结构退化、脆性增加和易发生骨折为特征[1]。OP多发于60岁以上老年人，尤其是绝经后的妇女发病率更高，称为绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）[2]。目前的研究认为PMOP的发生与体内雌激素的减少有关，因此对PMOP的治疗目前多采用的激素替代疗法，但是激素替代疗法可能增乳腺癌和子宫内膜癌的风险[3]，因此寻找新的防治PMOP的途径具有十分重要的意义。硫化氢（hydrogen sulfide，H2S）是一种具有腐臭鸡蛋气味的气体，被认为体内的第三种气体信号分子。H2S在体内广泛分布，心血管、内脏、神经系统和骨骼均有分布[4]。H2S具有广泛的生理作用，也参与了许多疾病的发生发展。研究显示H2S能保护氧化应激诱导的成骨细胞的损伤，保护成骨细胞的功能[5-6]。因此本研究选择去卵巢大鼠作为研究对象，模拟PMOP，用硫氢化钠（sodium hydrosulfide，NaHS）作为外源性H2S的供体，观察外源性H2S对PMOP的影响，并从护骨素（osteoprotegerin，OPG）和细胞核因子кB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）系统的角度探讨H2S抗OP的可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料

NaHS（Sigma公司），雌二醇（E2）放免法检测试剂盒（北京东雅生物工程公司），尿钙邻甲酚酞络合酮法检测试剂盒（南京天鼎生物技术研究所），脱氧吡啶啉ELISA法检测试剂盒（上海亿欣生物科技有限公司），BCA蛋白定量试剂为Pierce公司产品，兔抗鼠OPG、破骨细胞分化因子（RANKL）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）抗体以及辣根过氧化物酶标记二抗（美国Santa Cruz公司），LUNAR-DPXIC型骨密度仪（GE公司），HITACH717全自动生化分析仪（日本日立公司），全自动γ计数仪（上海第二仪器厂），MRXⅡ型酶标仪（美国Dynex公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备和分组清洁级成年雌性健康未交配SD大鼠50只，6个月龄，体重（250±20）g，由南华大学实验动物学部提供。大鼠适应性喂养1周后，于术前禁食过夜，自由饮水；选取其中40只大鼠用3.6%水合氯醛（10 mL/kg体重）腹腔注射麻醉，仰面固定，腹部常规消毒，做腹正中切口，找到双角子宫，沿子宫找到双侧卵巢，分离周围脂肪组织，完整摘除双侧卵巢。术后待大鼠自然清醒，青霉素（4万U/只）治疗3 d。双侧卵巢切除大鼠随机分成四组：去卵巢模型组、NaHS组（10、50、100μmol/kg）处理组，每组10只。剩下10只大鼠为对照组，进行假手术，不切除双侧卵巢。NaHS组大鼠腹腔注射用生理盐水溶解的NaHS，对照组和模型组给予等量生理盐水。大鼠由专人饲养，自由进食和饮水，12 h光照，温度控制在（22±3）℃。实验期为12周，实验过程中没有大鼠死亡。

1.2.2 骨代谢相关生化指标测定实验结束后，3.6%水合氯醛（10mL/kg体重）腹腔注射麻醉，打开胸腔，心脏放血，处死大鼠。留取膀胱中的尿液，采用邻甲酚酞络合酮法测定尿钙水平，采用ELISA方法测定尿脱氧吡啶啉（deoxypyridinoline，Dpd）水平，结果以每mmol肌酐（Cr）表示。取血清，用全自动生化分析仪测定血清钙、磷和血碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）水平，采用放免法测量血清E2水平。

1.2.3 股骨骨密度（boneminara l densi t y，BMD）检测实验结束大鼠处死后，迅速剔出大鼠的股骨，剔除周围的软组织，将右侧股骨用盐水纱布包裹置于冻存管中放入-80℃保存。然后用LUNAR-DPXIC型骨密度仪，采用双能X线吸收法测量大鼠右侧股骨中段的骨密度。

1.2.4 蛋白质印迹法检测OPG和RANKL表达大鼠处死后，迅速剔出大鼠的股骨，剔除周围的软组织，在-80℃保存。取股骨组织约200mg，加1mL细胞裂解液Buffer匀浆机中磨碎匀浆。4℃，2000 r/min离心30 min，取出上清液。采用总蛋白提取试剂盒按说明操作提取股骨组织总蛋白。BAC法测定蛋白浓度。取100μL蛋白质样本加入2×SDS凝胶加样缓冲液中煮沸使蛋白质变性。用6%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳1 h分离蛋白，将分离的蛋白用半干转膜仪转移至PVDF膜上，丽春红染色观察转移效果。10%脱脂牛奶室温下封闭2 h，加入兔抗鼠OPG（1∶200）和RANKL（1∶150）一抗，4℃过夜。TBST洗膜3次后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温下孵育2 h。蛋白质印迹荧光检测试剂盒显示于X线光片，经显影、定影后凝胶图像分析系统对胶片扫描，进行半定量分析。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H2S对去卵巢OP大鼠骨代谢相关指标的影响

与对照组比较，去卵巢OP模型组大鼠血清E2水平显著降低，差异有统计学意义（t=5.74，P＜0.05）；NaHS（10、50、100μmol/kg）组与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示NaHS没有影响大鼠体内的E2水平。与对照组比较，去卵巢OP模型组大鼠尿钙、尿Dpd、血清钙、血清磷和ALP水平显著增加，差异均有统计学意义（t=4.65、3.81、3.98、4.31、4.47，均P＜0.05）。与去卵巢OP模型组比较，NaHS（50、100μmol/kg）组大鼠尿钙、尿Dpd、血清钙、血清磷和ALP水平显著降低，差异均有统计学意义（F=4.67、3.92、3.89、4.23、4.15，均P＜0.05）。见表1、2。

表1 各组大鼠血清雌二醇、尿钙和尿脱氧吡啶啉水平比较（x±s）

表2 各组大鼠血清钙、血清磷和碱性磷酸酶水平的变化（x±s）

2.2 H2S对去卵巢OP大鼠BMD的影响

双侧卵巢切除后12周后取各组大鼠右侧股骨，用双能X线吸收法分别测定各组大鼠右侧股骨中段的BMD。结果如图1所示：与对照组比较，对去卵巢OP模型组大鼠股骨的BMD显著降低[（0.25±0.03）g/cm2和（0.14±0.01）g/cm2，t=3.85，P＜0.05）；与对去卵巢OP模型组比较，NaHS（50、100μmol/kg）组大鼠股骨的BMD显著增加[（0.14±0.01）g/cm2比（0.19±0.02）g/cm2和（0.23±0.03）g/cm2，F=6.42，P＜0.05）。

图1 硫化氢对去卵巢骨质疏松大鼠骨密度的影响

2.3 H2S对去卵巢OP大鼠股骨中OPG和RANKL表达的影响

双侧卵巢切除后12周后取各组大鼠左侧股骨，采用Western blot检测大鼠股骨中OPG和RANKL的表达。结果如图2所示：与对照组比较，去卵巢OP模型组大鼠股骨中OPG的表达显著降低[（0.68± 0.09）和（0.27±0.04），t=3.82，P＜0.05]，而RANKL的表达显著升高[（0.18±0.02）和（0.66±0.09），t=3.91，P＜0.05]；与去卵巢OP模型组比较，NaHS（50、100μmol/ kg）组大鼠股骨中OPG的显著升高[（0.27±0.04）比（0.48±0.05）和（0.64±0.08），F=4.84，P＜0.05），而RANKL的表达显著降低[（0.66±0.09）比（0.37±0.05）和（0.22±0.04），F=5.16，P＜0.05]。

图2 硫化氢对去卵巢骨质疏松大鼠股骨中护骨素和细胞核因子κB受体活化因子配体表达的影响

3 讨论

OP多发生于绝经后女性、老年人以及慢性病患者。OP的主要病理过程是在骨代谢过程中骨形成和骨吸收之间的失衡，导致机体内的钙磷代谢失衡，骨质丢失和骨密度减少。卵巢切除大鼠是研究PMOP的经典动物模型，大鼠切除卵巢后，体内雌激素的水平急剧降低，由于雌激素水平降低诱导破骨细胞分化和增殖，使骨形成减少而骨吸收增加，导致骨小梁数量减少、骨体积分数百分比降低和骨小梁的厚度变薄，最终引发OP[7-8]。复制PMOP动物模型常选择6～9个月的雌性大鼠，切除双侧卵巢，3个月后可形成OP大鼠模型。由于6～9个月的雌性大鼠骨的生长进入静止期，骨骺开始闭合，10个月左右达到峰值骨量，骨的代谢进入一个相对稳定的时期。切除雌性大鼠卵巢后，使松质骨的骨转换加快，骨量减少，骨强度和密度降低，这些特点类似于人绝经后的骨丢失导致OP的情况[9]。

骨形成和骨吸收两者紧密相联，骨代谢生化指标可反映骨代谢的情况，也反映骨的丢失。骨组织中含有大量的钙和磷，骨被吸收时骨钙和骨磷释放入血，使血钙和血磷水平增加，然后钙可从尿液中排出，使尿钙水平增加，因此尿钙、血钙和血磷水平可反映骨吸收和骨丢失的状态。Dpd是骨骼内Ⅰ型胶原的重要组成成分，是骨骼的特异性标志物，参与骨胶原合成过程中胶原分子间的交叉连接。在骨代谢中，骨溶解使骨胶原蛋白水解，而释放出Dpd进入血液中，最后从肾脏排出。因此尿Dpd水平可反映骨吸收的情况[10]。ALP是评价骨形成和骨转换最常用的指标。血清中ALP大约有50%来源于骨骼，ALP的活性可反映成骨细胞活性和状态，雌激素的减少使其对破骨细胞的抑制作用解除，骨的吸收增加，随之骨的形成也增加，导致高转换型OP，ALP值也相应增加[11]。本研究中通过切除SD大鼠的双侧卵巢来模拟PMOP的发生，在卵巢切除12周后，模型组大鼠与假手术对照组相比，血清E2水平和BMD降低，骨密度显著降低，尿钙、尿Dpd、血清钙、血清磷和ALP水平明显增加，说明骨代谢处于高转换状态，表明PMOP模型建立成功。

H2S是一种具有臭鸡蛋气味的气体，同NO和CO一样，具备作为细胞间以及细胞内传递信息的信使物质的基本要求，因此被称为第三种气体信号分子。在哺乳动物细胞内，以L-半胱氨酸为底物，主要由胱硫醚-γ-裂解酶、胱硫醚β合成酶、半胱氨酸转移酶和3-巯基丙酮酸转硫酶等催化产生H2S，这是体内H2S的主要来源，被称为内源性H2S。H2S有两种形式存在于体内，既NaHS和气体H2S。NaHS可溶于水，离解为Na+和HS-，而HS-可与H+可结合生成H2S，H2S和NaHS之间是一种动态平衡。由于NaHS比气体H2S更能够保证H2S浓度的精确性和稳定性，常被作为外源性H2S的供体[12]。H2S广泛分布于内脏、心血管、骨骼和神经系统等组织系统中，其生理作用非常广泛，也参与了多种疾病的发生发展。研究发现H2S通过p38和ERK1/2-MAPK信号通路抑制了双氧水诱导的成骨细胞MC3T3-E1细胞系的氧化损伤，对成骨细胞具有保护作用，增强成骨作用[5-6]。也有研究表明H2S可抑制破骨细胞的增殖，减弱破骨作用[13]。本实验结果表明外源性H2S增加了去卵巢OP模型大鼠的BMD，降低了尿钙、尿Dpd、血清钙、血清磷和ALP水平。这些结果表明表明H2S抑制了卵巢切除诱导的OP发生，参与骨代谢的调节和OP的发生发展，因此H2S有望成为OP治疗的新途径和新策略，但其抗OP的机制还不清楚。

OPG是成骨细胞分泌的一种蛋白质，它属于肿瘤坏死因子受体超家族的成员。RANKL是OPG的配体，又称破骨细胞分化因子，主要由成骨细胞分泌[14]。OPG/RANKL系统在成骨细胞刺激破骨细胞成熟的过程中起着十分重要的作用。RANKL与破骨细胞表面的RANK结合，通过激活核转录因子NF-κB和c-Fos、钙调磷蛋白磷酸酶、c-Jun N-末端激酶和p38以及丝氨酸-苏氨酸激酶Akt/PKB等途径使破骨细胞前体分化、存活、发育为成熟破骨细胞，促进骨的吸收。而OPG，由于其结构与RANK十分相似，从而竞争性抑制RANKL与破骨细胞膜上的RANK结合，抑制破骨细胞前体的分化，抑制成熟破骨细胞的活化，诱导破骨细胞凋亡，抑制骨的吸收[15]。RANKL和OPG的比例决定了破骨细胞介导的骨质吸收的发生、程度和过程[16]。本研究结果显示去卵巢OP大鼠股骨组织中OPG的表达明显降低，而RANKL的表达明显增加；而外源性H2S供体NaHS（50、100μmol/kg）却上调了大鼠股骨组织中OPG的表达，降低了RANKL的表达。这些结果说明外源性H2S抑制去卵巢大鼠中骨吸收，促进骨形成，具有抗OP的作用可能是通过调节OPG/ RANKL系统实现的。

总之，外源性H2S抑制了卵巢切除所引起的OP，其作用机制可能与H2S上调骨组织中OPG的表达而降低骨组织中RANKL的表达有关。本研究为PMOP的防治提供了新的线索和策略。

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Effects of extrogenous hydrogen sulfide on the bone m etabolism and expressions of osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor kappa B ligand in ovariectom ized ratsw ith osteoporosis

OU Qiong HUANG Yuliang ZHANG Qunfeng
Department of Gynaecology and Obstetrics,the Second Affiliated Hospital,University of South China,Hu'nan Province, Hengyang 421001,China

Objective To investigate the effect of extrogenous hydrogen sulfide(H2S)on the bonemetabolism and osteoprotegerin/receptor activator of nuclear factor kappa B ligand(OPG/RANKL)expressions in ovariectomized rats with osteoporosis.Methods 50 SD female rats were randomly divided into control group,ovariectomized osteoporosismodel group,and extrogenous H2Sdonator sodium hydrosulfide(NaHS)(10,50,100μmol/kg)treatment group,with 10 rats in each group.After 12 weeks,the levels of urine calcium and deoxypyridinoline(Dpd),serum calcium,serum phosphorus, serum alkaline phosphatase(ALP)and estradiol(E2)weremeasured.Bone mineral density(BMD)wasmeasured by a dual-energy X-ray absorptiometry.The expessions of OPG and RANKL in femur weremeasured by Western blot.Results Compared with the sham control group,the levels of E2in ovariectomized osteoporosismodel group[(76.83±8.12)pmol/L vs(11.05±1.42)pmol/L,t=5.74,P＜0.05]and BMD[(0.25±0.03)g/cm2vs(0.14±0.01)g/cm2,t=3.85,P＜0.05]were significantly decreased,the levels of urine calcium[(0.85±0.08)mg/L vs(1.88±0.21)mg/L,t=4.65,P＜0.05] and Dpd[(14.67±1.28)nmol/mmol vs(22.34±1.75)nmol/mmol，t=3.81，P＜0.05],serum calcium[(0.85±0.08)mg/L vs (1.88±0.21)mg/L,t=4.65,P＜0.05],serum phosphorus[(2.49±0.35)mmol/L vs(4.03±0.59)mmol/L,t=4.31,P＜0.05] and serum ALP[(78.65±5.23)U/L vs(167.35±1.75)U/L,t=4.47,P＜0.05]were significantly increased,the expression of OPG in the ovariectomized osteoporosismodel group was significantly decreased[(0.68±0.09)vs(0.27±0.04),t=3.82, P＜0.05]and the expression of RANKL in the ovariectomized osteoporosis model group was significantly increased [(0.18±0.02)vs(0.66±0.09),t=3.91,P＜0.05]in the ovariectomized osteoporosismodel group.Compared with the ovariectomized osteoporosis model group,the level of BMD in NaHS group(50,100μmol/kg)[(0.14±0.01)g/cm2vs (0.19±0.02)g/cm2and(0.23±0.03)g/cm2，F=6.42，P＜0.05]were significantly increased,the levels of urine calcium [(1.88±0.21)mg/L vs(1.39±0.09)mg/L and(0.97±0.09)mg/L,F=4.67,P＜0.05]and Dpd[(22.34±1.75)nmol/mmol vs (18.43±2.04)nmol/mmol and(15.75±1.14)nmol/mmol,F=3.92,P＜0.05],serum calcium[(4.68±0.52)mmol/L vs(3.98± 0.47)mmol/L and(3.56±0.25)mmol/L,F=3.89,P＜0.05],serum phosphorus[(4.03±0.59)mmol/L vs(3.11±0.42)mmol/L and(2.68±0.26)mmol/L,F=4.23,P＜0.05]and serum ALP[(167.35±1.75)U/L vs(115.69±8.72)U/L and(87.61±9.56)U/L, F=4.15,P＜0.05]were significantly decreased,the expression of OPG in the ovariectomized osteoporosismodel group were significantly up-regulated[(0.27±0.04)vs(0.48±0.05)and(0.64±0.08),F=4.84,P＜0.05]and the expression of RANKL were significantly down-regulated[(0.66±0.09)vs(0.37±0.05)and(0.22±0.04),F=5.16,P＜0.05]in the ovariectomized osteoporosismodel group.Conclusion Extrogenous H2S inhibits the osteoporosis induced by ovariotomy in rats,themechanism may be related to the up-regulation of OPG expression and the down-regulation of RANKL expression induced by H2S.

Hydrogen sulfide;Osteoporosis;Ovariectomized;Osteoprotegerin;Receptor activator of nuclear factor kappa B ligand

R274.9

A

1673-7210（2014）09（c）-0026-05

2014-06-11本文编辑：任念）

欧琼（1981.9-），女，硕士，主要从事绝经后骨质疏松症的防治研究。