二十二碳六烯酸对白介素1β诱导的动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响及机制探究

拓步雄 李超民 叶明霞 刘 薇 李 慧

解放军第四五一医院心血管内科，陕西西安710054

二十二碳六烯酸对白介素1β诱导的动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响及机制探究

拓步雄 李超民 叶明霞 刘 薇 李 慧▲

解放军第四五一医院心血管内科，陕西西安710054

目的探讨二十二碳六烯酸（DHA）对白介素1β（IL-1β）诱导的动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响及机制。方法血管平滑肌细胞（VSMCs）培养及传代后，分为对照组、IL-1β组、DHA组、IL-1β和DHA处理组四组，其中对照组细胞加入50μL磷酸盐缓冲液（PBS）；IL-1β组细胞加入10 ng/mL IL-1β；DHA组细胞加入80μmol/L DHA；IL-1β和DHA处理组加入10 ng/mL IL-1β和80μmol/L DHA，培养48 h后，噻唑蓝（MTT）法和Transwell法检测VSMCs的增殖和迁移情况；qRT-PCR和Western blotting技术检测基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、组织金属蛋白酶抑制剂（TIMP）-1、TIMP-2和Notch3的表达情况。结果VSMCs的增殖率和迁移能力经IL-1β处理后显著增高，而IL-1β和DHA处理组显著低于IL-1β处理组（F=25.537，P=0.003）；MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的表达量经IL-1β处理后显著增高，而经IL-1β和DHA共处理后显著低于IL-1β组（MMP-2：F= 34.286，P=0.000；TIMP-2：F=21.034，P=0.009；MMP-9：F=31.732，P=0.000；TIMP-1：F=18.213，P=0.021）；IL-1β组细胞Notch3表达量显著降低，IL-1β和DHA处理组中Notch3的表达水平则显著高于IL-1β处理组（F=39.235，P= 0.000）。结论DHA可通过Notch信号通路抑制VSMCs的增殖和迁移。

二十二碳六烯酸；白介素1β；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9；组织金属蛋白酶抑制剂-1；组织金属蛋白酶抑制剂-2；Notch3

血管壁结构的改变是高血压病理改变的普遍特征。目前普遍认为，高血压基本病理改变是血管重塑。动脉壁中膜肥厚是高血压血管壁增厚的主要原因，这与血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的增殖和迁移密切相关。研究表明多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic Acid，DHA）可降低心血管疾病的发病率和病死率[1]。DHA除了具有很好的降血脂作用外，还可以通过影响内皮细胞和VSMCs的生物学行为进而调节血压。在炎性反应中DHA可降低VSMCs的增殖和迁移[2-3]。研究表明，在高血压、血管再狭窄和动脉粥样硬化过程中VSMCs的增殖和迁移与基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase，MMP）降解细胞外基质密切相关[4]。当血管损伤后炎症因子高表达，上调MMP-2和MMP-9，使细胞外基质大量降解，加速了VSMCs向血管内膜迁移，导致血管壁增厚，引起血压上升，血栓形成[5-6]。目前，有关DHA的降血压机制的研究尚不多见。本文通过研究DHA对VSMCs增殖及迁移的影响，以及对基质金属蛋白酶及其抑制剂含量的变化探讨了DHA对高血压的影响及机制。

表1 引物列表

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雄性SD大鼠，山东绿叶制药有限公司动物实验中心提供，合格证号：20030020；干粉培养基（DMEM），美国Gibco公司生产；Trizol，加拿大Invitrogen公司提供；Quantscript RT kit，总RNA提取试剂盒购自于Takara公司；琼脂糖购自于BioWest公司；RIPA裂解液，购自于美国Millipore公司；DHA、噻唑蓝（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）和胰蛋白酶购自于Sigma公司；水套式二氧化碳孵箱，美国Nuaire公司生产；超净工作台，苏州净化设备公司生产；PCR仪：MJResearch INC生产。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养8周龄的雄性大鼠，颈椎脱臼处死，取胸主动脉，放入磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗。剥去动脉外膜及内膜，取血管的中层组织洗净后剪成1mm2大小的组织块，按组织贴块法接种于200mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，于5%CO2、37℃下培养24 h。待细胞达到80%的融合后，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化传代。

1.2.2 实验分组处理消化细胞并收集细胞悬液，将细胞以1×105/孔接种于24孔细胞培养板中，然后将细胞随机分为四组：对照组细胞加入50μLPBS培养48 h； IL-1β组细胞加入10 ng/mL IL-1β共培养48 h；DHA组细胞加入80μmol/L DHA培养48 h；IL-1β和DHA处理组细胞加入10 ng/mL IL-1β和80μmol/L DHA培养48 h。

1.2.3MTT检测细胞增殖细胞增殖采用MTT法进行检测。细胞消化后通过计数板计数，将细胞以1×104/孔的密度接种至96孔培养板中。接种12 h后，按上述分组方法进行培养。每组做6个重复。培养48 h后每孔加入5 g/L的MTT 20μL，37℃恒温箱中培养4 h，去上清，每孔加入200μL DMSO，振摇20 min，用紫外分光光度计测定570 nm下的光密度值（OD）。

1.2.4 Transwe l l法检测细胞侵袭在24孔Transwell上室聚碳酸酯膜（膜孔径8μm）上涂1 g/L的matrigel 70μL，37℃，60 min使之在微孔滤膜上重组为基底膜结构。取对数生长期的VSMCs，以DMEM培养液[不加胎牛血清（FBS）]，调整细胞悬液中细胞数为l×105/mL，取200μL细胞悬液接种于Transwell上室内，下室加入10%FBS的DMEM培养液500μL，37℃，5%CO2培养24 h后，将滤膜上层细胞用棉签抹去，滤膜以甲醇固定，然后用结晶紫染色15min。100倍光镜下选择膜上、下、左、右、中5个不同视野的穿过膜细胞数，求平均值。

1.2.5 qRT-PCR检测VSMCs细胞分组处理48 h后，利用PBS清洗细胞3遍，然后胰酶消化收集细胞，依据试剂盒说明，采用Trizol（Invitrogen，CA）抽提法提取总RNA，提取出的RNA用紫外分光光度计测OD值，以确定RNA的浓度和纯度；采用Quantscript RT kit反转录合成cDNA，PCR扩增。PCR扩增条件：94℃，1.5min；94℃，1 min；64℃，1 min；72℃，1 min 40个循环，最后在72℃下延伸10 min，同样的方法扩增内参基因三磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。引物信息见表1。

1.2.6 Wes te rn b l ot t ing检测蛋白表达细胞分组处理48 h后，利用PBS清洗细胞3遍，然后胰酶消化收集细胞，用RIPA细胞蛋白裂解液提取细胞中的蛋白，二辛可酸（BCA）法测定蛋白浓度。蛋白样品经SDS-PAGE电泳，上样量为40μg/行，电泳完毕后，电转移至PVDF膜进行如下处理：牛血清白蛋白（BSA）封闭过夜，一抗（1∶1000比例稀释）室温抚育2 h，磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗涤3次，辣根过氧化物酶（HRP）-IgG（1∶100比例稀释）室温抚育2 h，PBST洗涤3次，电化学发光（ECL）显色，暗室曝光。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS 13.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，两两比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VSMCs的增殖情况

MTT法检测VSMCs的增殖情况，结果显示，DHA组VSMCs的相对增殖率与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；而IL-1β组VSMCs的相对增殖率显著增高（P＜0.05）；IL-1β和DHA共处理组VSMCs的相对增殖率与IL-1β组VSMCs的相对增殖率相比显著下降（P＜0.01）。见图1。

图1 不同处理组血管平滑肌细胞的相对增殖率

2.2 VSMCs的迁移情况

Transwell法检测VSMCs的迁移，结果显示，DHA组VSMCs的穿膜均数为（18.24±5.31）个，与对照组[（22.17±4.58）个]比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；IL-1β组VSMCs的穿膜均数高达（64.72±21.35）个，显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；当经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养时，VSMCs的穿膜数量为（38.94±8.45）个，显著低于IL-1β组VSMCs的穿膜数量，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9和TIMP-1的表达

Western blotting检测MMP-2、TIMP-2、MMP-9及TIMP-1在VSMCs中的表达，结果显示，与对照组比较，DHA组VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值改变不显著，差异无统计学意义（P＞0.05）；而IL-1β组的VSMCs中MMP-2、TIMP-2、MMP-9、TIMP-1的表达量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05）。当经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养48 h后，细胞中的MMP-2、MMP-9的表达量和MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值与IL-1β组相比有显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、3。

图2 不同处理组血管平滑肌细胞中MMP-2和TIMP-2的表达

2.4 Notch信号通路关键调控因子Notch3在VSMCs中的表达

DHA组VSMCs中Notch3的表达量与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；Notch3在IL-1β组VSMCs中的表达量显著低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；当经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养48 h后，VSMCs中的Notch3表达量与IL-1β组相比显著增高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示DHA对VSMCs增殖和迁移的抑制作用是通过Notch信号通路实现的。见图4。

3 讨论

图3 不同处理组血管平滑肌细胞中MMP-9和TIMP-1的表达

VSMCs是构成血管壁的重要组成成分，其增殖过度是导致多种心血管疾病，尤其是高血压、动脉粥样硬化、血管再狭窄等的关键环节[7-8]。正常成熟的血管中VSMCs处于分化状态，当局部血管在炎症因子等刺激作用下损伤后，局部释放大量细胞因子和生长因子，使位于中膜的VSMCs表型发生改变，导致细胞收缩功能消失，并由中膜向内膜迁移、增殖，同时分泌大量的细胞外基质（extra-cellularmatrix，ECM）。本实验用炎症因子IL-1β对VSMCs进行了处理，诱导VSMCs细胞发生炎性反应，引起其大量增殖，然后用DHA进行处理，比较不同处理组VSMCs中MMP-2和MMP-9及其抑制剂的表达差异，并对Notch信号途径中的主要调控因子Notch3进行了检测，探讨DHA对VSMCs增殖和迁移的影响及机制。

MMPs是一类可降解ECM的锌蛋白酶家族，以酶原的形式分泌，由其他蛋白酶或炎症因子激活，在组织重构及ECM的动态平衡中发挥着重要作用[9]。TIMPs是MMPs的主要抑制剂，主要由肌成纤维细胞、VSMCs、激活的星形胶质细胞等分泌，其分泌为基本的生理所需，随MMPs的表达而表达，二者维持在一定的比例，调节ECM的动态平衡，若二者的比例失衡，将引起多种病理反应。本研究发现经IL-1β诱导的VSMCs的增殖及迁移能力显著增高，且MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2的表达量显著上调，MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值均显著增高，比例失调。与DHA共培养后VSMCs的增殖及迁移能力显著下降，MMP-2和MMP-9的表达量及MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值都表现为显著下调。说明VSMCs的增殖及迁移与MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比例失衡具有相关性，DHA可以降低MMP-2和MMP-9的表达量，从而降低MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比值，对抑制VSMCs的增殖及迁移发挥重要的作用。

图4 不同处理组血管平滑肌细胞中Notch3的表达

Notch信号通路一条最初发现于果蝇、高度保守的信号转导途径，广泛存在于各种生物体内。Armulik等[10]的研究发现Notch信号通路在调节VSMCs形态和功能中发挥重要作用。本研究发现：经IL-1β处理的VSMCs中低表达Notch3；经IL-1β处理的VSMCs与DHA共培养后Notch3的表达量表现为显著增高，VSMCs的增殖和迁移能力也显著降低，说明Notch3在DHA抑制平滑肌细胞增殖和迁移中发挥重要作用。

DHA对VSMCs生理功能的调节作用已被多个研究所报道[11-12]。有研究认为ω-3不饱和脂肪酸特别是DHA一方面极易与膜磷脂或三酰甘油相融合并增加VSMCs膜固醇类的流动从而对与胞膜密切相关的信号分子产生影响[13]，而另一方面对细胞膜离子通道进行调控，最终调节细胞内的信号转导[14]。

综上所述，本研究发现DHA可以降低炎性反应所引起的VSMCs中MMP-2和MMP-9的高表达，调节MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的比例，抑制VSMCs的增殖和迁移，在高血压的病理过程中发挥重要作用。同时，本研究发现DHA发挥调节作用的过程中Notch3起到了关键性的作用，此结果提示DHA作用的发挥可能是通过Notch信号通路实现的。

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Effect and mechanism study of Docosahexaenoic Acid for vascular smooth muscle cells proliferation and m igration induced by IL-1β

TUO Buxiong LIChaomin YEMingxia LIUWei LIHui▲
Department of Cardiology,the 451st Hospital of PLA,Shaanxi Province,Xi′an 710054,China

Objective To study the effect and mechanism study of Docosahexaenoic Acid(DHA)for vascular smooth muscle cells(VSMC)proliferation and migration induced by interleukin(IL-1β).Methods Subcultured VSMCswere divided into four groups:control group,DHA group,IL-1βgroup and IL-1βcombined with DHA group.Cells were cocultured with 50μL PBS in control group,with 10 ng/mL IL-1βin IL-1βgroup,with 80μmol/L DHA in DHA group,with 10 ng/mL IL-1βand 80μmol/L DHA in IL-1βcombined with DHA group for 48 h.MTT and Transwell methodswere used to detect VSMCs proliferation andmigration.qRT-PCR and Western blottingmethodswere used to measure the expression ofmatrixmetalloproteinase(MMP)-2,MMP-9,tissue inhibitor ofmetalloproteinase(TIMP)-1, TIMP-2 and Notch3.Results The proliferation and migration of VSMCs significantly increased in IL-1βgroup,while the proliferation andmigration ability of VSMCs significantly decreased compared with IL-1βgroup(F=25.537,P=0.003). In IL-1βgroup,the expression of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 significantly increased(P＜0.05),whereas the expression of MMP-2,MMP-9,TIMP-1 and TIMP-2 in IL-1βcombined with DHA group significantly decreased compared with IL-1βgroup(MMP-2:F=34.286,P=0.000;TIMP-2:F=21.034,P=0.009;MMP-9:F=31.732,P=0.000; TIMP-1:F=18.213,P=0.021).The expression of Notch3 in IL-1βgroup was significantly lower,while in the IL-1β combined with DHA group the expression of Notch3 was significantly higher than that in the IL-1βgroup(F=39.235, P=0.000).Conclusion DHA can inhibit VSMCs proliferation and migration through the Notch signaling pathway.

Docosahexaenoic Acid;IL-1β;MMP-2;MMP-9;TIMP-1;TIMP-2;Notch3

R544.1

A

1673-7210（2014）09（c）-0021-05

2014-05-25本文编辑：卫轲）

▲通讯作者