动物肠道黏膜抗菌肽维持微生物区系平衡机制研究进展

蔡 杰 唐 志如 邓 欢 孙 志洪 赖 星

(西南大学动物科技学院，生物饲料与动物营养重点实验室，重庆 400715)

肠道微生物作为宿主的共生生物，能改善消化、吸收、合成维生素以及抑制病原菌的生长［1］。同时宿主通过控制肠道微生物数量、组成及分布来维持肠道微生物的动态平衡［2］。在此过程中，与微生物菌群相互作用的肠上皮细胞发挥了极其重要的作用。宿主肠道免疫防御系统产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，称为抗菌肽。抗菌防御系统和多样化的微生物经过长期的进化，建立了多种防御机制，以保证微生物与宿主肠道细胞互惠共存［3］。在肠道内最有代表性的抗菌肽是防御素(defensins)、cathelicidins(如LL-37)、C型凝集素［再生胰岛衍生蛋白(REG)家族］、核糖核酸酶(RNases)和S100蛋白(如钙卫蛋白)，在调节肠道微生物菌群结构与肠黏膜屏障的动态平衡中发挥着重要作用。

1 动物消化道微生物概述

动物肠道微生物菌群组成复杂，主要包含细菌，也包括一些真核生物、病毒和古细菌。在正常情况下，动物肠道内大约含有200种正常菌群，每克肠道内容物含109个细菌以上，主要以厌氧菌为主，如拟杆菌(Bacteroides)、双歧杆菌(Bifidobacteria)、乳杆菌(Lactobacillaceae)等。其数量和种类可随动物种类、年龄、饲料、抗菌物质、环境、疾病等因素变动，在同一动物的不同消化道中也有差异。单胃动物由于胃酸的杀菌功能，胃内只含少量微生物。而反刍动物在长期进化过程中形成了相对稳定而复杂多样的瘤胃微生物。小肠内，因各种消化液的杀菌作用，细菌数量相对较少。大肠内消化液杀菌作用减弱，且残余食物多，营养充足，细菌数量增加。正常情况下，消化道微生物的种类、数量、定植部位相对稳定。微生物之间及微生物与宿主之间处于互惠共生、相互制约的动态平衡。此时，微生物具有营养、提高免疫力、拮抗等作用。一旦平衡被破坏，菌群失调，则可能引起动物生产能力的降低，甚至产生疾病。

2 常驻微生物和上皮屏障功能之间的关系

在肠道中，微生物和宿主间存在广泛的互作效应，一方面肠道黏膜可有效阻挡微生物，防止病原体的感染，通过细胞免疫和体液免疫途径，在多种免疫效应因子共同作用下，影响肠道微生物的分布和组成［4］;另一方面，肠道共生菌对肠道免疫系统的发育和稳态的维持具有重要作用［5］。宿主与微生物的共存平衡取决于复杂多层次的肠道屏障。肠道上皮屏障是由肠上皮细胞、肠黏液层、肠黏膜免疫系统、肠道正常微生物群等组成的防御系统［6］。

肠道上皮屏障构成宿主抵御微生物和有害物质的第1道防线，采用不同的保护机制，形成错综复杂的固有免疫措施网络。肠上皮细胞利用模式识别受体(PRR)来监测固有肠道菌群，通过病原相关分子模式(PAMP)或微生物相关分子模式(MAMP)来识别微生物［7］。PAMP是微生物(或其产物)上某些非特异性、高度保守的分子结构。研究发现，监测肠道菌群的MAMP/PAMP-PRR对于肠道屏障功能至关重要［8］。当受到各自配体的刺激时，PRR诱导第1道防线发挥快速、连续的防御措施。这些防御措施包括抗菌肽、协调信号分子以及黏蛋白的产生和释放［9］。

肠道PRR包括跨膜表面Toll样受体(TLR)和细胞内核苷酸结合寡聚化结构域分子(NOD)等［10］。由PRR激活的细胞反应通过不同的信号分子和级联系统介导，如髓样分化主要基因髓样分化因子(MyD88)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)以及细胞核因子κB(NF-κB)信号通路。激活的防御措施旨在消除潜在的危险，并且引导后续的趋化因子调解的急性炎症细胞的补充和进一步促进NF-κB介导的反应［11］。近年来，对特定PRR功能以及总体肠道固有识别机制的研究促进了对防御屏障的认识。研究热点也由此从短时间内对病原体的免疫反应转移到共生微生物的可持续动态平衡。

显然，在这个结构体系中，PRR必须允许一定量的肠道菌群的存在，以避免持续的过度激活。保持低活性的机制是限制PRR的表达。例如，在人的结肠中，TLR3(识别与病毒感染相关的dsRNA)和TLR5(感测细菌鞭毛蛋白)大量表达，而TLR2(可以由不同的脂肽激活)［12］和 TLR4［能够识别脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)］在健康的肠道中表达量低［13］。此外，在小肠上皮中发现PRR的选择性表达通过细胞内胞壁酰二肽传感的NOD2进行，主要位于潘氏细胞(paneth cell，PC)内［14］。

抑制PRR介导的炎症信号的第2个重要因素是肠黏液层的存在。小肠上皮被单一的独立黏液层所覆盖，而结肠有2个明显的黏液区，内层附着而外层低密度区域保持游离［15］。在结肠内，外在的黏液层构成共生微生物的栖息地，而内在的黏液层是一个无菌的密封层［16］。这种黏液层不仅是物理屏蔽，它还能保留上皮细胞产生的抗菌物质，从而组成防止微生物附着和入侵的第1道防线［17］。

因此，通过PRR监测肠道菌群，肠道上皮细胞迅速而有效地表达抗菌肽、协调信号分子、黏蛋白，以抵御外来病原微生物，防止肠道微生物菌群的失调和易位，同时肠道菌群的平衡和黏液层的存在调节PPR的活性，使细胞因子及其他促炎症因子维持在正常的低水平状态，从而使常驻微生物和上皮屏障功能之间的平衡得以维持。如果某一环节出现异常，如抗菌肽或黏蛋白的表达减少，便会使菌群失调或易位，上皮屏障功能失效，并引起相应的疾病。

3 肠道抗菌肽防御素与微生物动态平衡关系

肠上皮细胞针对细菌、病毒、原生动物和真菌产生特定的防御物质，防御素是其中一种。肠道防御素是一类富含半胱氨酸残基的低分子质量的内源性抗菌肽，包括α-防御素、β-防御素和θ-防御素，其转录诱导和分泌依赖于PRR。防御素除了能直接杀死病原体外，还可以调节机体的免疫反应。PC位于肠腺底部，能合成和分泌多种抗菌效应分子，其中就包括小肠PC防御素。

3.1 α－防御素在肠道内的作用

α-防御素的蛋白质结构特征包括:1)由32～36个氨基酸残基组成;2)分子内含有6个保守的半胱氨酸形成的3对二硫键，形成稳定的反向平行的3股β-折叠片结构域;3)具有一个3～4 ku的保守双亲性结构，带有阳离子和疏水性残基。

小肠α-防御素对肠道微生物的调节主要依赖于其广谱、高效的抗微生物活性，在肠隐窝和肠腔中发挥作用。小肠通过感知肠道有害细菌后释放α-防御素。α-防御素在肠隐窝内维持一定浓度，从而保护邻近的细胞免受肠道细菌侵袭。与此同时，α-防御素选择性地杀灭肠道内的微生物从而维持肠道内正常菌群的组成和动态平衡。而且，α-防御素的分泌又受到菌群的调节以维持肠道菌群的完整［18］。

此外，α-防御素还通过免疫调节维持微生物区系平衡。α-防御素通过刺激肠隐窝分泌液体，使其运送到肠腔中，进入肠腔中的防御素由于肠液的稀释浓度降低，但仍可抑制肠道内革兰氏阴性(G-)菌的过度增殖，维持肠道正常菌群的平衡。当α-防御素随着肠液及肠内容物的移动，到达远离分泌的部位，其浓度进一步降低，这时防御素可作为化学趋化剂，调节免疫效应细胞(如记忆性淋巴细胞和树突状细胞等)的功能，达到有效调节微生物区系的功能。

3.2 肠道黏膜抗菌肽β－防御素与肠道微生物动态平衡的关系

动物肠上皮细胞分泌的防御素主要是β-防御素。哺乳动物β-防御素的蛋白质结构特征包括:1)一般由38～42个氨基酸残基组成;2)分子内包含3个二硫键，由3对保守的半胱氨酸残基组成，肽链折叠形成3条反向平行的β-折叠片层;3)蛋白质分子内含有4个保守的氨基酸残基，即苏氨酸、赖氨酸、脯氨酸和甘氨酸，且精氨酸含量丰富;4)哺乳动物β-防御素前体一般由64～68个氨基酸残基组成，包含N-端信号肽、前肽序列和C-端成熟肽［19］。哺乳动物β-防御素分子质量较小，二硫键和β-折叠结构可使防御素蛋白质紧密联结，以防止蛋白酶水解，这是动物防御素能抵御外源微生物的重要因素，也是区别于其他抗微生物肽的结构基础［20］。

β-防御素对革兰氏阳性(G+)菌、G-菌、某些真菌、螺旋体等都具有杀伤性，其中对哺乳动物β-防御素敏感的病原体包括多种细菌和原虫［21］。β-防御素抗菌的机制具体过程如下:微生物细胞膜因含磷脂酰基甘油和磷脂酰基丙氨酸而带负电荷，而G-菌外膜含有LPS和G+菌细胞壁含有肽聚糖(peptidoglycan，PGN)，糖醛酸或糖醛酸磷壁酸加剧了细菌细胞膜的负电荷。肠上皮细胞释放的阳离子β-防御素能结合带负电荷的微生物细胞膜，以二聚或多聚体的形式将分子内的疏水肽段插入到外源微生物的细胞膜内，使细胞膜产生细孔而通透性增加，从而破坏细胞膜的完整性，导致细胞内物质泄漏，最终引起细胞死亡，另外β-防御素还能改变胞内的信号和抑制核酸合成［22］。

当外源微生物入侵机体时，可以引起β-防御素的防御反应，但β-防御素在体内与宿主其他的防御免疫组分一起来抵抗细菌、病毒和寄生虫的机理仍不是太清楚。已有研究发现，促炎症反应细胞因子［如白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素1α(IL-1α)和肿瘤坏死因子 α(TNF-α)］和微生物的组成成分，如LPS和鞭毛蛋白(flagellin)通过特殊的受体［如白细胞介素1受体(IL-1R)、肿瘤坏死因子受体(TNF-R)和 TLR］和信号通路［如NF-κB、激活蛋白 1(AP-1)、MAPK］能诱导人 β-防御素2(hBD-2)和人β-防御素3(hBD-3)在结肠的上皮细胞中表达［23］。

4 抗菌肽维护宿主微生物稳态的研究进展

在正常生理状况下，肠道细菌并不对动物机体产生危害，这得益于肠道特有的屏障功能。而上皮细胞抗菌肽是这个屏障系统中重要的部分。通过小鼠模型研究表明，抗菌肽能阻止共生微生物以及病原微生物入侵。例如，通过TLR9刺激，广泛诱导PC脱颗粒释放抗菌肽以保护小鼠免受鼠伤寒沙门氏菌的感染［24］。研究表明，猪β-防御素1(pBD1)和猪β-防御素2(pBD2)能够影响猪肠上皮细胞中紧密连接蛋白和黏蛋白的基因表达［25］。黏蛋白参与肠道黏膜屏障的组成，当有细菌感染时，机体能够通过增加黏蛋白的表达抵御肠道病原微生物的侵袭。而且pBD1和pBD2可通过破坏细菌细胞膜杀灭特定病原菌，且细胞毒性较小。这显示pBD1和pBD2能够影响肠道黏膜屏障功能，降低有害微生物对机体带来的伤害。Bao 等［26］、Liu 等［27］的研究均表明，动物肠道来源的抗菌肽可以增强鸡的肠黏膜免疫。Yu等［28］研究发现，从鸡肠道提取的抗菌肽可显著提高鸡血清免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白M(IgM)含量，增强鸡的体液免疫。添加抗菌肽AD可以提高仔猪空肠中免疫球蛋白A(IgA)的分泌，以及血液中 IgA、IgG、IL-1β、白细胞介素-6(IL-6)的水平，以此增强免疫能力并降低断奶仔猪肠道致病菌［29］。

抗菌肽能保持肠道微生物组成的恒定。而炎症情况下很可能影响抗菌防御，并降低抗菌肽对微生物的这种稳定作用。如营养不良、腹泻、肠道通透性增加、细菌易位、抗菌肽的表达差异都与常驻菌群在肠道微生态失衡相关［30］，由此可能带来肠道微生物菌群的改变。而在各类动物中常见的肠道菌群易位，可能与上皮防御素的减少相关［31］。另外，反刍动物由于其特殊的生理特性，维持瘤胃微生物区系的稳定尤为重要，抗菌肽作为机体自身免疫的组成部分，其优良的广谱抗菌性能作用机理特殊，不仅可以抵抗外来致病菌，微生物也不易产生抗性，更重要的是不会对自身微生物区系造成破坏。

抗菌肽在肠道中具有塑造微生物群落的作用。如采用聚合酶链式反应-变性梯度电泳(PCRDGGE)技术测定抗菌肽B对不同日龄雏鸡的盲肠、回肠微生物群的作用，发现饲喂抗菌肽B的雏鸡与空白对照组相比微生物菌群存在很多不同［32］。余绍海［33］研究表明，抗菌肽可显著降低鸭肠道中大肠杆菌的数量，优化了肠道菌群，进而保障了肠道健康。研究发现，在饲粮中添加抗菌肽可以改善肉兔小肠黏膜形态，刺激盲肠有益菌的增殖并抑制有害菌的增殖［34］，引起家兔盲肠总好氧菌和大肠杆菌的数量呈现不同程度的下降，而乳酸杆菌、双歧杆菌及总厌氧菌数量呈现不同程度的增加［35］。Wu等［29］在猪上饲用抗菌肽研究结果也表明，抗菌肽可提高盲肠乳酸杆菌及总厌氧菌的数量，降低大肠杆菌和总好氧菌的数量。而且当猪的饲料中添加的抗菌肽逐渐增加时，回肠、盲肠、粪便中总厌氧大肠杆菌、大肠菌群、梭状芽胞杆菌呈线性下降［36］。Peng 等［37］在罗非鱼上研究表明，抗菌肽通过改变致病菌的黏附力，可有效阻止致病菌在肠道上的定植，达到抑制致病菌生长的目的。此外，抗菌肽也可通过直接作用于致病菌，发挥抗菌活性，抑制肠道有害菌的生长，减少大肠杆菌等有害菌对益生菌生长的竞争抑制作用，使肠道菌群保持相对稳定的动态平衡。反之，肠道菌群的稳定使正常菌群产生乳酸、乙酸，甚至是自身抗生素，从而阻止致病菌的定植和增殖。有研究表明，肠道菌群可能在激活和维持TLR的表达和动态平衡中发挥重要作用，这也显示了其对自身调节的一个重要机制，同时抗菌肽还可减少产氨菌数量、氨基酸脱氨率和氨产量［38］。在反刍动物瘤胃中有大量抗菌肽，因此，抗菌肽可用于特定微生物区系的选择以调节瘤胃发酵过程。抗菌肽通过改变瘤胃微生物组成，提高生产效率，维持健康，降低瘤胃发酵相关疾病发生［39］。

在动物生产过程中，抗菌肽已经作为一种新型饲料添加剂应用于动物饲料中。其不仅有效抑制病毒，而且对大肠杆菌、布氏杆菌、绿脓球菌、链球菌、葡萄球菌有很强的杀灭作用［40］。国内作为添加剂生产应用的抗菌肽主要是蚕抗菌肽AD-酵母制剂，可以预防仔猪腹泻、鸡白痢等。而且相较于抗生素，抗菌肽不易引起耐药性，对环境污染小，在绿色畜牧业发展中有广泛前景。

5 小结

用营养学方法调控肠道微生物区系，预防消化道微生物区系平衡的破坏而带来的一系列疾病，无疑符合于治“未病”这一理念，也体现动物疾病控制中“防重于治”这一方针。抗菌肽是控制肠道菌群的关键，一旦产生和分泌异常，可能导致由细菌引起的消化道等疾病。除了直接杀灭病原体、调节肠道菌群，抗菌肽还有调节适应性免疫应答的作用。抗菌肽、肠道菌群、先天免疫信号、上皮细胞增殖途径之间的相互作用极其复杂。肠道中抗菌功能的紊乱会影响屏障功能的有效性并可能促进微生物菌群的变化。此外，肠道菌群成分的改变可以影响上皮防御，并使其变得不稳定。对肠上皮的宿主-微生物相互作用的进一步研究有助于我们更好地理解这些现象，并有望获得改善动物肠道健康与提高生产性能的新对策。弄清抗菌肽合成和释放的机制后，通过用其各自最敏感的微生物感染，我们或许可以找到如何通过动物高效生产抗菌肽的方法，以解决生物化学合成肽类成本高的问题，使抗菌肽广泛运用于生产实践及临床疾病治疗。

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