细菌毒力与β－内酰胺类抗生素耐药的相关性

耿 健，李绍雪，周 维，张德显，刘明春

（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866）

β－内酰胺类抗生素是一类含有β－内酰胺环的抗生素，主要包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类和β－内酰胺酶抑制剂等。细菌对β－内酰胺类抗生素耐药的机制比较复杂多样，在革兰阳性菌和革兰阴性菌中表现不同。在革兰阳性菌，主要通过药物作用靶位的改变、β－内酰胺酶对药物的破坏作用、细菌的主动外排系统、自身基因突变以及获得性外源基因等而产生耐药性；而在革兰阴性菌，主要通过渗透屏障、β－内酰胺酶对药物的破坏作用、细菌主动外排系统、自身基因突变以及获得性外源基因等产生耐药性。

青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins，PBPs）表达减少或者突变是革兰阳性菌对β－内酰胺类抗生素耐药的重要机制，而革兰阴性菌对β－内酰胺类抗生素耐药则主要是由于β－内酰胺酶的产生和细菌细胞膜通透性的改变而导致的［1］。致病菌的定植、感染和引起疾病的能力主要取决于其自身对抗生素的耐药性、宿主本身所产生的抗菌物质（胆酸、脂肪酸等）和宿主自身的免疫力［2］。据报道，细菌获得耐药性对其毒力的改变也有重要影响［3］。有些细菌耐药性的产生使其致病力更强，更难以清除，已经引起临床的广泛关注。本文综述了细菌毒力与其对β－内酰胺类抗生素耐药之间的相关性，期望对深入探讨细菌耐药机制及有效防治耐药菌引起的感染性疾病提供依据。

1 青霉素结合蛋白的改变对细菌耐药性和毒力的影响

PBPs是β－内酰胺类抗生素作用的主要靶位。β－内酰胺类抗生素能专一性地与细菌细胞膜上的PBPs结合，干扰PBPs的正常酶活性，从而干扰肽聚糖的合成，使细胞壁合成受阻，最终导致细菌死亡。PBPs结构和数量的改变是细菌对β－内酰胺类抗生素产生耐药的重要机制之一［4］。

在PBPs家族中，金黄色葡萄球菌的PBP2、肺炎链球菌的PBP2b－PBPX和鲍曼不动杆菌的PBP7－8能够影响其细菌毒力基因的表达。Rudkin J K等［5］研究表明，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌能够影响其生物膜的表型降低其毒力，并能够降低蛋白酶的产生以及降低其对小鼠的致病力，并证明耐甲氧西林金黄色葡萄球菌通过干扰细菌群体感应调节系统而降低细菌的毒力基因的表达。Pozzi C等［6］研究表明，细胞壁自溶素、纤维结合蛋白、胞间多糖黏附素（poly－saccharide intercellular adhesin，PIA）和多聚 N－乙酰氨基葡萄糖（polymeric N－acetylglucosamine，PANG）能够促进金黄色葡萄球菌分离株生物膜的表达，对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌生物膜的产生与胞间多糖黏附素或多聚乙酰氨基葡萄糖有关，而耐甲氧西林金黄色葡萄球菌分离株能够表达Atl／FnBP介导的生物膜表型，这表明甲氧西林耐药诱导细胞壁的改变能够影响细菌的群体感应调节系统，从而导致了细菌毒力基因表达量的减少，并且能够降低对鼠脓毒症模型致病力。Rieux V等［7］研究发现，改变了PBPX和PBP2b使青霉素敏感菌株改变成青霉素耐药菌株在转换之后，肺炎链球菌的毒力显著降低了。有关革兰阴性杆菌中PBPs改变对毒力的影响研究数据较少，只见有关鲍曼不动杆菌方面的报道。Russo T A等［8］筛选了鲍曼不动杆菌pbpG上的突变，可编码低分子质量的PBP7～PBP8。研究表明，这种突变体在大鼠软组织感染模型和大鼠肺炎模型中具有较低的致病力，且有助于鲍曼不动杆菌在体内和体外的存活。

2 β－内酰胺酶的表达对细菌耐药性和毒力的影响

大肠埃希菌ST131能够产生广谱的CTX－M－15型β－内酰胺酶而呈多重耐药，并且该致病菌已经在国际范围内广泛传播，CTX－M－15型β－内酰胺酶也在多种细菌中发现，包括产毒志贺菌O111：H8［9］和O26：H11［10］，以及从西班牙猪场和鸡场分离得到的大肠埃希菌中都发现了CTX－M－15型β－内酰胺酶。从产生CTX－M－15型β－内酰胺酶的大肠埃希菌分离株已经检测到多种毒力基因［11］，以及产生NDM－1型内酰胺酶的大肠埃希菌ST131中发现存在多种毒力基因［12］。以上研究表明，β－内酰胺酶和毒力基因能够共同存在于特定的大肠埃希菌菌株体内，是细菌共同进化的结果。

然而，目前仍不清楚特殊β－内酰胺酶基因的存在能否影响细菌的致病能力。至少在产CTX－M－15型β－内酰胺酶的大肠埃希菌没有对其毒力产生影响［3］。Dubois D等［13］研究表明，从新生儿脑膜炎患者中分离出的一株大肠埃希菌携带有3个不同的质粒，其中一个产生CTX－M－1型β－内酰胺酶，编码β－内酰胺的质粒不能促进新生小鼠脑膜炎模型的发生率。这表明CTX－M型酶在动物模型中不能增加大肠埃希菌的毒力。另外，有学者研究表明，在携带有blaIMP基因（编码β－内酰胺酶的基因）的铜绿假单胞菌毒力基因的表达未受到影响［14］。

关于β－内酰胺酶的产生对细菌活力的影响研究比较少，在抗生素存在的情况下，细菌的耐药性及其活力对细菌的存活具有重要意义。最近有学者对含有 OXA－24、OXA－10和 SFO－1型β－内酰胺酶的大肠埃希菌中的肽聚糖链的长度进行了定量研究，结果表明，胞壁肽聚糖交联的表达水平出现明显降低，而肽聚糖链的长度显著增加，这些改变能够在统计学意义上降低细菌在体内外的活力［15］。以上研究提示，β－内酰胺酶和肽聚糖合成及代谢具有重要的联系。

3 外膜孔蛋白对细菌耐药性和毒力的影响

外膜孔蛋白是β－barrel生物膜蛋白，是位于细菌细胞膜上能够使特定物质通过的一类孔道。营养物质、毒素和抗生素等能通过孔蛋白扩散进入细菌体内。外膜孔蛋白的改变、修饰和外膜孔蛋白表达量的减少都与细菌耐药程度有关［16］。外膜孔蛋白在影响细菌毒力和细菌耐药性方面具有至关重要的作用。

Alejandro B［3］研究表明，细菌外膜蛋白具有外膜孔蛋白的功能，不仅控制抗菌药物进入细胞膜，也能控制病原微生物的毒力基因的表达。最新研究证实，鲍曼不动杆菌的外膜孔蛋白OmpA与先锋霉素的耐药有关［17］。另外2种外膜孔蛋白CarO和Omp33～Omp36在特定情况下与碳青霉烯类耐药有关［18］。Fernandez Cuenca F 等［19］证明鲍曼 不 动杆菌的毒力减弱能够导致编码外膜孔蛋白CarO和OprD－like的基因表达量的减少。由 Omp33～Omp36介导的鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药与细菌的凋亡和自噬过程有关。此外，Cabral M P等［20］的研究表明，鲍曼不动杆菌的外膜孔蛋白Caro和Omp33～Omp36参与菌毛的形成过程。OmpA和Omp33～Omp36蛋白以及TonB的转运体被证实为菌毛结合蛋白，可影响病原菌和宿主的相互作用。因此，这有利于探讨鲍曼氏不动杆菌对宿主细胞的黏附过程。

在大肠埃希菌中，OmpC的丢失能够导致抗生素耐药性，并降低抗体依赖性的杀菌活性［21］。此外，OmpC蛋白与克罗恩病患者中细菌的黏附、入侵和肠道定植有关［22］。在大肠埃希菌中OmpF表达量的降低和缺失可使外膜通透性降低，从而阻碍抗生素进入细胞产生耐药性［23］。Bekhit A等［24］证明OmpC和OmpF（这2个蛋白主要与细菌的耐药性有关）对大肠埃希菌能在强酸性环境中生存至关重要。OmpF也参与Hep－2细胞黏附。肺炎克雷伯菌的OmpK35和OmpK36外膜蛋白参与头孢唑啉、头孢西丁和美罗培南的耐药性。在△OmpK36和△OmpK35／36缺失株，能够显著降低抗生素对致病菌的最小抑菌浓度，△OmpK36缺失株对小鼠腹膜炎模型的毒性显著降低；但若菌株中△OmpK35和△OmpK36共同缺失，则该缺失株的LD50出现最大值。上述研究表明，肺炎克雷伯菌外膜孔蛋白缺乏可能增加抗生素耐药性，同时使致病性降低。在肠杆菌科的其他成员和脑膜炎奈瑟菌、铜绿假单胞菌也出现了类似的结果。

4 外排泵对细菌耐药性和毒力的影响

细菌的多重耐药外排泵与天然耐药及获得性耐药有关，包括本身存在于黏膜表面的一些外排泵和一些遗传元件携带的获得性外排泵。外排泵能使细菌定植于宿主黏膜表面，而且多重耐药外排泵能去除包括细菌感应稳态系统在内的多种毒力因子［25］。外排泵也被证明参与胞内代谢物的解毒和细菌毒力（包括动植物宿主），以及细胞内稳态和胞间信号的传递。外排泵主要包括耐药结节细胞分化家族（resistance－nodulation－division，RND）、小多重耐药家族（small multidrug resistance，SMR）、多药物与毒物外排家族（multidrug and toxic compound extrusion，MATE）、主要易化超家族（major facilitator superfamily，MFS）、ATP结合盒转运体家族（ATP－blinding cassette，ABC）。其中，RND 家族在β－内酰胺类耐药中起到重要作用。

RND家族转运蛋白是导致革兰阴性菌多重耐药性的主要原因。RND家族中研究较多的是大肠埃希菌中的AcrAB－TolC，由药物质子转运子AcrB、膜融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC组成。AcrB有一个跨膜结构域，延伸入周质或细胞质后形成巨大的结合区域，当药物进入革兰阴性菌的周质或细胞质后，随即被内膜上的AcrB捕获，然后与AcrA形成AcrAB复合体，再与TolC结合，导致其构象变化形成内在通道，将各种药物排出［26］。RND家族转运蛋白对于细菌的致病性也起重要作用，主要影响病原微生物在宿主体内的定植、感染和持续性存在。

AcrAB－TolC外排泵在多种细菌中发现介导抗生素耐药和毒力，包括大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌、布鲁菌［27］；以及非致病的微生物，如青枯雷尔菌。据报道，由于致病基因表达量减少导致沙门菌AcrAB－TolC缺失株毒力明显减弱［28］。Padilla E 等［29］研究表明，敲除acrAB的肺炎克雷伯菌菌株和野生菌株相比在引起肺炎鼠模型中表现出较低的致病力。显然，外排泵的去除能够影响毒力和抗生素耐药。因此，外排泵可导致细菌的耐药性同时使细菌的毒力增强。

目前的研究资料表明，4种对β－内酰胺类抗生素耐药机制之间没有明显联系。细菌对β－内酰胺类抗生素耐药性和毒力之间的关系主要表现为在金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和鲍曼不动杆菌中由PBPs结构和数量的改变可导致的耐药能够使细菌的毒力降低。大肠埃希菌中β－内酰胺酶导致的耐药不能对细菌毒力产生影响。在肠杆菌科中由外膜孔蛋白缺失和表达量降低导致的耐药对细菌毒力的降低产生重要影响，而在大肠埃希菌中外排泵导致的细菌耐药可使细菌的毒力增强。国内外研究均认为细菌耐药性问题严重，细菌较易产生耐药性，随着时间的推移细菌的耐药率大幅上升，多重耐药菌株迅速增加，对常用抗生素产生广谱耐药。目前关于细菌毒力与耐药的相关性的一些机制还有待进一步研究，相信随着研究的不断深入，必将揭示细菌毒力与耐药的相关性，为有效防治耐药菌引起的感染提供重要的理论支撑。

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