云南高海拔牧场牦牛捕食线虫真菌生防高效菌株的筛选

舒凡帆，代 琦，苏锡钧，苏子峰，苏鸿雁

（大理学院农学与生物科学学院，云南大理 671003）

云南是我国牦牛生产的重要基地之一，牦牛是牛属（Bosspp.）动物中能适应高寒气候条件的特有种类，是唯一能够充分利用高山牧场自然资源的牛种〔1〕。大理花甸坝牧场、中甸打日坝牧场、白马雪山牧场牦牛养殖是当地农牧民生产生活的源泉之一。近年来，由于草原放牧的牦牛与其他各种家畜交错放牧，接触频繁，致使牦牛感染寄生虫病情况处于上升趋势〔2〕。长期以来，控制和预防牦牛消化道线虫病主要以化学药物为主，但药物无节制的使用不仅易导致耐药虫株大量产生，而且会造成药物残留在畜产品中的食品卫生安全问题。用化学药物进行线虫病防治副作用较大，如虫体抗药性问题、药物残留及药物代谢产物影响生态环境等问题，而且绝大多数化学药物仅对成虫起作用，对虫卵及幼虫无能为力。因此，人们一直在寻求新的防治方法〔3〕。

捕食线虫真菌（nematode-trapping fungi）是线虫重要的天敌之一，且广泛存在于自然界中，其通过菌丝特化形成各种捕食结构捕食线虫，是目前研发寄生线虫生防制剂的重要资源〔4〕。其特点是在线虫幼虫感染动物之前将其杀死，避免家畜的感染或重复感染〔5〕。国外畜牧业发达的国家，如新西兰、澳大利亚等，已成功将捕食线虫真菌开发成生防制剂，并成功应用于家畜寄生线虫病的防治〔6-7〕。国内许多学者在这一领域也取得了显著的成果〔8-10〕。

然而，对于特定牧区寄生线虫的生物防治，土著生防菌因长期适合本地区自然环境条件而成为首选的评估资源，该类生防菌不仅需具有抗消化的能力，还需具有较强的捕食活力〔11〕。通过前期对云南3 个高原牧场：大理花甸坝牧场、中甸打日坝牧场、白马雪山牧场捕食线虫真菌资源的初步调查，已获得40株捕食线虫真菌。本实验拟从中选出12株捕食线虫真菌做体外抗消化试验并测定捕食率，拟筛选出具有抗消化能力且捕食活力较高的生防菌株，以期为牦牛及其它动物线虫病的生物防治提供捕食线虫真菌菌种资源。

1 材料和方法

1.1 供试菌由大理学院农学与生物科学学院微生物实验室分离于云南大理花甸坝，中甸打日坝牧场及白马雪山牧场新鲜耗牛粪便〔12-13〕，共12株捕食线虫真菌，包括3株少孢节丛孢（A.oligospora）、3株弯孢节丛孢（A. musiformis），3 株椭圆隔指孢（D. ellipsospora）及3 株长孢隔指孢（D. leptospora）。见表1。

表1 抗盐酸胃蛋白酶的捕食线虫真菌筛选结果

1.2 线虫秀丽隐杆线虫（Paragrellus redivius）：参照文献〔14〕方法制备新鲜有活力的第三期线虫幼虫，用无菌水将其制成每100 μL约含50条线虫幼虫悬液。

1.3 培养基CMA（玉米粉琼脂）：参照文献〔15〕方法制备0.4 g/L玉米粉琼脂培养基。

1.4 盐酸-胃蛋白液胃蛋白酶按1%（W/V）的浓度配制，然后用10%的稀盐酸调节pH值到2.5，现配现用。

1.5 抗盐酸-胃蛋白酶试验将12 株供试菌株分生孢子分别加入39 ℃预热的盐酸-胃蛋白酶溶液离心管中，混匀后置于39 ℃培养箱作用4 h。分别取少量溶液接种于CMA 培养基，置25 ℃温箱中培养7 d 后，在超净工作台上用体视镜观察是否有目标菌的生长，向生长的菌株中加入第三期幼虫，培养24 h后观察捕食器官形态结构，以确认并筛选目标耐受菌株。

1.6 耐受菌株捕食器官产生数量比较根据“1.1”试验的结果，比较耐受盐酸-胃蛋白酶溶液的捕食线虫真菌捕食器官产生数量的情况。将耐受菌株接种于CMA培养基中央，设立不接种菌株的空白对照组，在25 ℃条件下培养7 d后，向其中加入第三期幼虫溶液200 μL。试验分7组，每组3个培养皿，分别在5、10、15、20、25、30、35 ℃条件下培养，24 h 后观察捕食器官产生情况：在培养皿中随机取20个直径为5 mm 的圆形区域，在体视镜下测其捕食器官数，计算出捕食器官数/cm2。采用SPSS 11.5 统计软件对不同温度下菌株产生的捕食器官数进行方差分析，其中，P＜0.05为差异有统计学意义。

1.7 耐受菌株捕食线虫活性比较根据“1.1”、“1.2”试验结果，比较最适温度下，耐受盐酸-胃蛋白酶溶液的捕食线虫真菌捕食活性情况。将耐受菌株接种于CMA 培养基中央，每株接种3 个培养皿，设立不接种菌株的空白对照组，在25 ℃条件下培养7 d后，向其中加入第三期幼虫溶液200 μL，在25 ℃条件下培养，24 h后在培养皿中随机取10个直径为5 mm的圆型区域，在体视镜下观察记录真菌对线虫幼虫的捕食情况，按公式计算出菌株捕食线虫活性即捕食率（%）。捕食率（P）=被捕获的虫体数（X）/〔X+自由活动虫体数（Y）〕×100%。

2 结果

2.1 抗盐酸-胃蛋白酶试验12个供试菌株中6个菌株通过了盐酸-胃蛋白酶处理，总通过率50.00%，其中A. oligospora，A. musiformis，D. ellipsospora，D.leptospora通过率分别为66.66%、66.66%、33.33%、33.33%。结果：从12株菌株中成功筛选到6株耐盐酸-胃蛋白酶的捕食线虫真菌。见表1。

2.2 耐受菌株捕食器官产生数量比较在5～35 ℃之间，A.oligospora、A.musiformis的 4 株耐受菌株均能产生不同数量的捕食器官，而D.leptospora、D.ellipsospora的2株耐受菌株在5 ℃以下或35 ℃以上不产生捕食器官。另外，在25 ℃条件下，各耐受菌株产生的捕食器官数最多，与其它温度差异具有统计学意义（P＜0.05），相对而言，在25 ℃条件下，A.oligospora的Ao-HDB、Ao-DRB及D.ellipsospora的De-BMXS 产生的捕食器官数较A. musiformis的Am-HDB、Am-DRB 和D. leptospora的 Dl-DRB 高（P＜0.05）。结果表明，25 ℃条件下6株耐受菌株均能产生较多的捕食器官，其中A.oligospora的2株及D.ellipsospora的1株耐受菌产生捕食器官的能力相对较强。见表2。

表2 耐受菌株在不同温度下产生的捕食器官数量比较

2.3 耐受菌株捕食线虫活性比较6 株耐受菌捕食率在23.40%～77.77%之间，均显示出一定的捕食活性。其中，A. oligospora的 Ao-HDB、Ao-DRB 及D. ellipsospora的 De-BMXS 捕食率较高，分别为77.77%、70.52%、68.81%；其次为A. musiformis的Am-HDB、Am-DRB，捕食率分别为53.84%、47.12%；最低的是D.leptospora的Dl-DRB，仅有23.40%。结果再次表明，6 株耐受菌中A. oligospora的2 株及D.ellipsospora的1株耐受菌的捕食线虫活性相对较强。见表3。

表3 耐受菌株25 ℃条件下捕食活性比较

3 讨论

在动物生防控制中，通过将捕食线虫真菌加入饲料使之出现在粪便，用以捕捉粪便中的线虫幼虫是防治动物线虫病理想的方法，因此用于生物防治的捕食线虫真菌需具有一定的抗消化能力〔16〕。有研究表明大多数捕食线虫真菌由于不能耐受瘤胃液和真胃中的盐酸胃蛋白酶液作用，因而在实验室进行体外抗消化筛选可快速得到耐消化的捕食线虫真菌〔11，17〕。根据本次试验结果，12株云南高海拔牧场牦牛粪便中的捕食线虫真菌中有6株通过盐酸胃蛋白酶处理，通过率50.00%。

捕食线虫真菌在营养贫瘠的环境中若存在新鲜幼虫，真菌很快就会形成捕食器官捕食幼虫以补充营养来源的不足〔18〕。本实验在5～35 ℃之间，加入幼虫后，6 株耐受菌在20、25 ℃时产生的捕食器官最多，这与杨晓野等〔19〕已有研究基本一致，只是A.oligospora产生的捕食器官数略高于D.ellipsospora，但差异不具有统计学意义，这可能与菌株来源于高海拔牧场有一定的关系。根据产生捕食器官的数量，我们从6株耐受菌株中初步筛选出Ao-HDB、Ao-DRB 及De-BMXS 3 株产生捕食器官的能力相对较强的菌株。

由于捕食线虫真菌主要作用于寄生线虫在环境中的自由生活阶段。因此，对真菌体外捕食线虫效力的测定能为其防治线虫效果提供重要参考依据〔15〕。孟庆玲等〔18〕对A.oligospora新疆分离株的捕食活性进行研究，结果表明菌株在CMA培养基上捕食率达到92.8%～97.6%。杨晓野等〔19〕对A. oligospora和D.ellipsospora的捕食效力进行研究，结果表明菌株在CMA 培养基上捕食率达到78.2%和80.1%。本研究中3 株产生捕食器官数量较多的耐受菌Ao-HDB、Ao-DRB及De-BMXS捕食率分别为77.77%、70.52%、68.81%，也表现出较强的捕食线虫活性。

同一捕食线虫真菌在不同的地区可能存在着菌株的差异，云南高海拔牧场独特的地理环境和气候条件使得捕食线虫性真菌云南分离到的菌株生物学特性和捕食能力与其它地区分离到的菌株有所不同，因此筛选出本地自然环境条件下适应本地气候、生态环境和动物饲养管理条件的菌株尤为重要。本研究筛选到了3株能耐受盐酸胃蛋白酶液作用且具有较强捕食活性的捕食线虫真菌，可为研制适合于云南高原牧场牦牛及其它动物线虫病高效生物防治菌剂提供菌种资源。但该3株捕食线虫真菌是在实验室条件下筛选到的，是否能正常通过动物体内的消化液，并在外界保持有效地捕食活力还有待进一步研究。

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