mtND5基因12338、12358和12406位点突变与弱精子症的相关性分析

骆慧盈，李传连，楼哲丰，郑九嘉，张李雅，金龙金

（1.浙江省医学遗传学重点实验室，温州医科大学 检验医学院，浙江 温州 325035；2.娄底市中心医院 检验科，湖南 娄底 417000；3.温州医科大学附属第一医院 生殖医学中心，浙江 温州 325015）

mtND5基因12338、12358和12406位点突变与弱精子症的相关性分析

骆慧盈1，李传连2，楼哲丰1，郑九嘉3，张李雅3，金龙金1

（1.浙江省医学遗传学重点实验室，温州医科大学 检验医学院，浙江 温州 325035；2.娄底市中心医院 检验科，湖南 娄底 417000；3.温州医科大学附属第一医院 生殖医学中心，浙江 温州 325015）

目的：探讨mtND5基因12338、12358和12406位点突变与弱精子症的相关性。方法：按照WHO标准收集55例弱精子症患者和33例精子活力正常者的精液标本，通过PCR及测序检测mtND5基因12338、12358和12406三个位点的突变，分析比较两组基因突变频率及活力的差异。结果：弱精子症组中精子mtND5 12338突变率（为10.91%）、12358突变率（为9.09%）、12406突变率（为12.73%）和三位点总突变率（为32.73%）均高于正常对照组（分别为9.09%、3.03%、3.03%和15.15%），但差异无统计学意义（P＞0.05）。进一步分析两组的精子活力发现，突变组与非突变组a级精子百分率分别为（20.63±13.63）%、（30.61±18.87）%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；a+b级精子百分率分别为（29.66±17.08）%、（41.44±22.47）%，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A可能与精子活力有一定的相关性。

弱精子症；精子活动力；mtND5；突变

不孕不育是一种严重影响人类生殖健康的疾病，且其中约有一半的原因是男性因素所致，称为男性不育。由于生活方式的改变、社会工业的不断发展及环境污染的加剧，男性不育患者日趋增加[1]。目前，它已成为一个全球关注的热点问题。

据Hirsh[2]报道，男性不育症中约有一半是由于男方精子质量异常或性功能障碍所致。其中精子质量低下是其重要原因之一，而精子活动力则是衡量精子质量的一项重要指标。依据WHO标准[3]，精子活力分为4个等级：a级为快速前向运动精子，b级为慢速前向运动精子，c级为原地运动精子，d级为静止精子。当a级＜25%且a+b＜50%时，可诊断为弱精子症。精子活动的能量主要源自线粒体，当线粒体结构或功能异常时，精子活力会受到一定影响。

近年来，mtDNA突变和缺失与男性不育的相关研究越来越多的引起关注。有关精子线粒体基因突变与精子活力低下的相关研究已有一些报道。本实验室已往的研究中也曾报道mtATPase基因变异[4]，mtND2、mtND3和mtND4L基因突变[5-6]与精子活力低下可能有一定相关性。迄今为止，对mtND5基因的研究陆续发现，mtND5基因突变与Leber遗传性视神经病变、遗传性肥厚性心肌病有一定相关性，然而，mtND5基因点突变与弱精子症的相关性研究国内外尚鲜有报道。为了解mtND5基因变异与弱精子症的相关性，本研究通过基因测序检测到mtND5 12338、12358和12406三个位点的突变，并对这三个突变位点与弱精子症的相关性进行了分析，为进一步分析mtND5基因突变与弱精子症的相关性提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象弱精子症和正常对照组精液标本来自温州医科大学附属第一医院生殖医学中心，根据WHO修订标准，通过计算机辅助精液分析系统（CASA）分析，选取精子活力低下（a级＜25%且a+b级＜50%）患者55例，正常对照标本（a级＞25%或a+b级＞50%）33例，所有精液标本在采集前禁欲3～5 d，手淫法收集，在37 ℃孵育20～30 min，待其完全液化后进行分析。所有病例和对照均签订知情同意书。

1.2 主要试剂PCR扩增引物参照文献[7]，上游5’-TAT CAC TCT CCT ACT TAC AG-3’，下游5’-AGA AGG TTA TAA TTC CTA CG-3’，扩增产物为866 bp。引物由宝生物（大连）工程有限公司合成。PCR聚合酶试剂、DNA片段纯化试剂盒为宝生物工程（大连）有限公司产品；蛋白酶K为Merk公司产品；琼脂糖、Tris试剂为Promega公司进口分装。

1.3 方法

1.3.1 精子线粒体DNA的提取：用PBS洗涤已液化的精液标本2～3次，56 ℃消化4～6 h，酚-氯仿法抽提精子线粒体DNA，Elution Buffer溶解。

1.3.2 PCR反应和产物鉴定：2μ L DNA模板，上游和下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，MgCl2（25 μmol/L）3 μL，PCR（10×）缓冲液4 μL，dNTP（200 nmol/L）4μL，Taq聚合酶（5μmol/L）0.25 μL，ddH2O补足至40μL。反应条件为94 ℃预变性5 min，94 ℃变性 30 s，58 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 40 s，共35个循环，最后在72 ℃终止延伸6 min。扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.3 PCR产物的纯化和测序：按宝生物工程（大连）有限公司DNA片段纯化试剂盒说明书进行PCR产物的纯化，然后送上海鼎安生物科技有限公司进行正向测序。

1.4 突变分析利用CodonCode Aligner软件将测序结果与Mitomap数据库（www.mitomap.org）上提供的人类线粒体剑桥序列进行比对，对检测出的核苷酸变异位点进行仔细核对峰图确认。将突变前后的密码子编码的氨基酸性质进行分析。

1.5 统计学处理方法采用SPSS17.0软件将序列比对结果进行统计分析，组间突变率的比较采用卡方检验，精子活力的比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增结果PCR扩增后，产物经琼脂糖凝胶电泳显示与预期产物片段大小一致（见图1）。

图1 mtND5基因PCR产物电泳图

图2 mtND5 m.12338T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A突变测序峰图

2.2 序列比对和突变频率分析测序结果与修正后剑桥序列进行比对，55例弱精子症患者中mtND5基因的3个位点，分别发生了m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A突变（见图2），与正常对照组相比，三个位点的突变频率及总变异率均高于对照组（见表1），但差异无统计学意义（P＞0.05）。我们进一步对88例样本分为突变组和非突变组，并对这两组的精子活动力数据进行了统计分析，发现突变组的a级精子百分率和a+b级精子百分率显著低于非突变组（P＜0.05）（见表2）。

2.3 mtND5基因错义突变氨基酸性质分析通过Mitomap数据库查找分析，发现三个突变位点中，m.12358 A＞G突变使极性亲水性氨基酸（苏氨酸）变为非极性疏水性氨基酸（丙氨酸），而另外两个突变位点仅发生所编码的氨基酸改变，无极性改变（见表3）。

表1 mtND5 m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A突变在弱精子症组和正常对照组中的突变率

表2 突变组与非突变组a级、a+b级精子百分率的比较（%）

表3 mtND5基因三个错义突变位点的氨基酸极性改变

3 讨论

ND5是氧化呼吸链NADH-脱氢酶复合体的七个亚基之一，与细胞能量代谢有关。精子的活力强弱在受精中起着重要的作用，只有在快速前向运动的精子达到一定数量时，才能与卵子结合形成受精卵。若精子能量代谢障碍，则可能会产生精子活力降低，导致生殖障碍。

ND5亚基对于复合体I的活性是不可或缺的[8-9]。mtND5基因经常被报道于各种各样的表型，包括MELAS、LHON、MERRF和Leigh综合征[10-11]。mtND5基因的一些突变会影响复合体I的酶活性，其中文献[12]报道，mtND5 m.12338T＞C突变可能与Leber遗传性视神经病变相关。Liu等[13]在对mtND5与母系遗传性肥厚性心肌病的研究时发现，mtND5 m. 12338 T＞C与母系遗传肥厚性心肌病的发生也有一定的相关性，是肥厚性心肌病的危险因素之一。Chamkha等[14]在对婴幼儿Pompe病研究时，在mtND5基因上也发现了一个新的突变位点，如m.12908 T＞A。但是在弱精子症中mtND5基因突变尚鲜见报道。

我们对m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A三个位点突变对精子活动力进行相关分析发现，精子活力a级与a+b级百分率在突变组中均显著低于非突变组，差异均有统计学意义（P＜0.05），说明这三个位点突变对精子活力可能有一定作用。再对这三个位点突变前后的氨基酸变化情况分析发现，m.12358 A＞G（Thr→Ala）突变使编码的极性亲水性氨基酸（苏氨酸）变为非极性疏水性氨基酸（丙氨酸），这种氨基酸性质的改变可能影响蛋白质空间构象从而影响其功能，再结合该位点突变在弱精子症组高于对照组，我们推测m.12358 A＞G突变可能影响线粒体的功能，影响精子活力。m.12338T＞C突变位于mtND5基因的起始密码子，当发生突变时，使编码蛋氨酸的起始密码子变为编码苏氨酸的非起始密码子。由于起始密码子的突变，理论上推测可能使多肽链的翻译受阻，从而使精子线粒体功能异常，进而影响精子活力。然而在我们的实验中观察到在对照组中也存在m.12338 T＞C突变，由于弱精子症与对照组精子活力只是数量上的差异，对照组个体精液中也存在一定比例的不活动或活动力差的精子，对照组中我们检测到的m.12338 T＞C突变的3例标本c+d级精子百分率分别为51.5%、49.3%和36.6%，这可能是对照组中出现m.12338 T＞C突变的原因，有待于进一步的研究。

在弱精子症组中，mtND5 m.12338 T＞C、m. 12358 A＞G和m.12406 G＞A三个位点突变率高于对照组，这从另一方面支持这三个突变对精子活动力的影响，但突变率在两组间的比较差异无统计学意义，产生这一结果的原因之一我们推测这3个突变位点可能对精子活力的影响较小，仅仅是一种量的作用，但是不是产生弱精子症的特异性原发致病突变位点，有待于进一步的研究；原因之二可能是检测的病例数偏少，有待扩大样本量做进一步的分析。

根据以上分析，我们认为m.12338 T＞C、m.12358 A＞G和m.12406 G＞A可能与精子活力有一定的相关性，但是不是弱精子症的特异性原发致病突变有待于进一步的研究。

[1]Qin Y, Han X, Peng Y, et al. Genetic variants in epoxide hydrolases modify the risk of oligozoospermia and asthenospermia in Han-Chinese population[J]. Gene, 2012, 510(2): 171-174.

[2]Hirsh A. Male subfertility[J]. BMJ, 2003, 327(7416): 669-672.

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[4]金龙金, 李传连, 费前进, 等. mtATPase6基因变异与弱精子症的相关性分析[J]. 细胞生物学杂志, 2008, 30(5): 660-666.

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（本文编辑：吴健敏）

Correlative analysis of asthenospermia and the mutation site of 12338, 12358 and 12406 in mtND5

LUO Huiying1, LI Chuanlian2, LOU Zhefeng1, ZHENG Jiujia3, ZHANG Liya3, JIN Longjin1.1.School of Laboratory Medicine and Life Science, Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325035; 2.Clinical Laboratory, Loudi Central Hospital of Hu’nan, Loudi, 417000; 3.Reproductive Medicine Center, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To investigate the correlation between asthenospermia and the mutation site of 12338, 12358 and 12406 in mtND5.Methods:Fifty-five semen samples from patients with asthenospermia and 33 from healthy donors based on WHO criteria were collected and analyzed, mutation frequency of 12338, 12358 and 12406 in mtND5 was examined by polymerase chain reaction (PCR) and sequencing.Results:The mutation frequency (m.12338 T>C 10.9%, m.12358 A>G 9.09%, m.12406G>A 12.7%, total 32.73%) in asthenospermia group was higher than the frequency in control group (9.09%, 3.03%, 3.03% and 15.15%), but there was no significant difference between them (P>0.05). However, the percentages of grade a (20.63±13.63) and grade (a+b) (29.66±17.08) sperm in mutation samples (with m.12338 T>C or m.12358 A>G or m.12406 G>A) were significantly lower than that in non-mutation samples (30.61±18.87 and 41.44±22.47) (P<0.05).Conclusion:These mutations of m.12338 T>C, m.12358 A>G and m.12406 G>A in human sperm may have some correlation with sperm motility, but may not be the specific mutation site of asthenospermia.

asthenospermia; sperm motility; mtND5; mutation

R394.3

A

1000-2138（2014）03-0169-04

2013-11-26

浙江省教育厅科研基金资助项目（Y201223693）；温州市科技合作项目（H20090063）。

骆慧盈（1988-），女，河南濮阳人，硕士生。

金龙金，教授，Email：1304071636@qq.com。