HBV S-ecdCD40L治疗性疫苗对乙肝转基因小鼠肝脏中树突状细胞表型和功能的影响

吴文治，徐英，吴金明，张欢

（温州医科大学附属第一医院 消化内科，浙江 温州 325015）

HBV S-ecdCD40L治疗性疫苗对乙肝转基因小鼠肝脏中树突状细胞表型和功能的影响

吴文治，徐英，吴金明，张欢

（温州医科大学附属第一医院 消化内科，浙江 温州 325015）

目的：检测HBV S-ecdCD40L表达对乙肝转基因小鼠树突状细胞（DC）成熟分化和功能的影响及其可能机制。方法：乙肝转基因小鼠分别肌肉注射质粒pcDNA3.1-S-ecdCD40L、pcDNA3.1-S、pcDNA3.1或PBS，每只100 μg/25 g，2、4周后各加强免疫一次。首次免疫6周后，取血，分离DC，检测细胞表型及功能，并用荧光定量PCR法检测血清HBV DNA含量。结果：注射pcDNA3.1-S-ecdCD40L小鼠DC中CD80、CD86、MHC II及Toll样受体4（TLR4）的表达，白介素-12（IL-12）的分泌及刺激淋巴细胞的能力均高于其余组小鼠，而平均血清HBV DNA含量明显低于其余组小鼠。结论：pcDNA3.1-S-ecdCD40L重组表达载体介导的HBV S-ecdCD40L表达能有效地促进转基因小鼠的DC成熟分化和功能提高，激活DC中的TLR4可能是其机制之一。

乙型肝炎病毒；树突状细胞；Toll样受体；小鼠

虽然安全有效的乙肝疫苗被各国列入婴儿常规免疫近20年，但乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染仍是全球关注的健康问题。据统计目前全世界至少有4亿人感染HBV，其中我国就有1.2亿感染者，且每年有超过100万的患者死于HBV相关的肝病，如肝硬化、肝癌等。因此控制HBV的复制，缓解肝组织活动性病变仍是医学界需要长期努力攻克的堡垒。本实验采用HBV转基因小鼠代替慢性乙肝患者，通过对照比较检测疫苗pcDNA3.1-S-ecdCD40L介导的HBV S-ecdCD40L表达能否有效刺激转基因小鼠树突状细胞（dendritic cell，DC）成熟及其可能的机制。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1 动物：HBV转基因小鼠购自解放军第458医院全军肝病中心，该小鼠为高表达复制型1.3拷贝HBV全基因转基因小鼠。

1.1.2 疫苗：pcDNA3.1-S-ecdCD40L重组表达载体[1]、pcDNA3.1-S载体均来自本室前期构建。

1.1.3 试剂：HBV DNA定量试剂盒购自深圳匹基公司；CDllc microbead、磁柱均购自Miltenyi Biotec公司；PE/FITC标记的CD80、CD86、MHC I I及Toll样受体4（Toll like receptor 4，TLR4）均购自Ebioscience公司；IL-12p70酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒购自RD公司；CCK-8购自日本同仁公司；胶原酶IV购自Sigma公司。

1.2 免疫转基因小鼠称重后，随机分为四组，分别肌肉注射pcDNA3.1-S-ecdCD40L（pcDNA3.1-S-ecd CD40L组）、pcDNA3.1-S（pcDNA3.1-S组）、pcDNA3.1（pcDNA3.1组）或PBS（PBS组），每只100 μg/25 g，首次免疫2周和4周后各加强免疫1次，每次100 μg/25 g。首次免疫6周后，处理小鼠。

1.3 肝脏微环境DC分离培养参照Lu等[2]分离肝脏DC的方法并作一些改进。HBV转基因小鼠戊巴比妥腹腔麻醉，无菌开腹，1 mL注射器针头门静脉注射20 mL含EGTA 0.19 g/L D-Hanks液，肝脏变白后，下腔静脉注射5 mL 0.5%胶原酶IV，取肝脏，剪碎后，放入0.5%胶原酶中继续消化，37 ℃，30 min。尼龙网过滤，PBS清洗，稀释成4～5 mL细胞悬液，percoll密度梯度离心后吸取两液体界面的非肝实质细胞，PBS清洗2次。免疫磁珠法分离肝脏DC（按免疫磁珠说明书操作）。按每l×107个细胞用80:l磁珠分离液重悬细胞并加入20 μL CDllc+磁珠的比例操作，4 ℃孵育15 min，经细胞磁性分离系统阳性分选CDllc阳性细胞，用含lO%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞，调整细胞浓度为4×105个/mL。

1.4 外周血淋巴细胞分离培养稀释后血液与淋巴细胞分离液1:1，2 000 r/min，密度梯度离心20 min后，吸取白膜层，加15%血清完全培养液培养，隔天取不贴壁细胞，即为淋巴细胞。

1.5 DC表型和功能鉴定

1.5.1 DC表型及TLR4表达检测：取EP管，每管加100μ L DC悬浮液，分别加入PE-CD86、FITC-CD80、PE-MHC I I、PE-TLR4及同型各5μ L，室温避光20 min，PBS洗1次，加150 μL 1%多聚甲醛固定，4 ℃保存，流式细胞仪检测细胞表型。

1.5.2 混合淋巴细胞反应：分离培养小鼠T淋巴细胞作为效应细胞，DC作为刺激细胞，DC/T比值为1:5、1:10、1:20 等，另设只含淋巴细胞的孔为对照组，含RPMI 1640的孔为本底组。培养结束前4 h，每孔各加入CCK-8 20μL，继续孵育4 h，振荡混匀后，于参比波长630 nm、检测波长450 nm处检测吸光度（A值）。刺激指数（SI）=（A实验组-A本底组）/（A对照组-A本底组）。

1.5.3 细胞因子检测：收集混合淋巴细胞反应培养96 h上清液，采用ELISA法检测IL-12，按试剂盒说明书进行操作。根据试剂盒中标准品的检测结果绘制标准曲线，酶标仪检测出样品的A值，在标准曲线上换算出对应细胞因子的含量。

1.5.4 血清HBV DNA荧光定量检测：样本处理及定量PCR检测按深圳匹基公司HBV荧光PCR试剂盒操作流程进行。分别取0、3、6周的小鼠，眼眶后静脉丛采血，每次0.3 mL左右，37 ℃恒温箱孵育30 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上层血清各50μL，加入50μL DNA提取液1，振荡混匀，10 000 r/min离心10 min，弃上清，再加入12.5 μ L DNA提取液2，振荡混匀，2 000 r/min离心10 s。100 ℃沸水浴10 min，13 000 r/min离心10 min，取上清2μ L进行PCR检测。由电脑软件分析计算给出HBV DNA初始拷贝数定量结果。

1.6 统计学处理方法采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。所有数据均以±s表示。采用单因素方差分析法比较各组间的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DC表型及TLR4表达检测pcDNA3.1-S-ecdCD40L组CD80、CD86、MHC I I表达分别为61.36 ±5.95、60.61±5.25、77.71±3.09，较pcDNA3.1-S组、pcDNA3.1组和PBS组均显著增高（均P＜0.05），见图1。pcDNA3.1-S-ecdCD40L组、pcDNA3.1-S组、pcDNA3.1组和PBS组的TLR4表达分别为（40.88± 8.79）%、（35.35±7.41）%、（29.30±3.64）%和（28.93±3.18）%，pcDNA3.1-S-ecdCD40L组与pcDNA3.1组、PBS组比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

图1 各组DC表面CD80、CD86和MHC I I表达

2.2 混合淋巴细胞反应pcDNA3.1-S-ecdCD40L组SI最高，DC/T比值为1:5时，SI=3.00±0.32；DC/ T比值为1:10时，SI=2.49±0.31；DC/T比值为1: 20时，SI=1.63±0.24。当DC/T比值为1:5及1: 10时，pcDNA3.1-S-ecdCD40L组SI与另外三组相比有明显提高（均P＜0.05）；当DC/T比值为1:20时，pcDNA3.1-S-ecdCD40L组SI与其他三组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。表明该组DC刺激T淋巴细胞增殖的能力最强，且DC/T的比值越大，DC的刺激能力越强。见图2。

图2 混合淋巴细胞反应

2.3 细胞因子检测pcDNA3.1-S-ecdCD40L组上清液中IL-12p70含量为（107.16±19.09）pg/mL，pcDNA3.1-S组、pcDNA3.1组和PBS组分别为（72.23 ±23.60）pg/mL、（23.89±4.68）pg/mL和（23.19 ±4.21）pg/mL， pcDNA3.1-S-ecdCD40L组IL-12p70含量明显高于其余三组（均P＜0.05）。

图3 乙肝转基因小鼠HBV DNA荧光定量检测

2.4 血清HBV DNA荧光定量检测免疫治疗6周后，pcDNA3.1-S-ecdCD40L组小鼠平均血清HBV DNA拷贝数明显低于其他三组。见图3。

3 讨论

HBV感染的彻底控制和清除有赖于机体的免疫系统。DC作为体内作用最强的抗原递呈细胞，在HBV感染控制中起到重要作用。研究认为HBV可能通过影响DC分化和成熟，进而影响辅助T细胞的分化，导致Th1/Th2失衡，致使特异性细胞免疫功能降低，HBV感染得以慢性化[3]。所以DC分化成熟是治疗HBV感染的关键。

我们的前期体外试验证明，pcDNA3.1-S-ecdCD40L成功转染的DC表型及刺激淋巴细胞增殖的能力有很大的提高[4]。为了进一步验证该治疗性疫苗能否在活体内取得同样的效果，我们采用转基因小鼠代替慢性乙肝患者进行检验。通过与另外三组对比，由pcDNA3.1-S-ecdCD40L介导的HBV S-ecdCD40L表达能有效刺激转基因小鼠DC成熟，细胞表面抗原CD80、CD86、MHC I I表达提高，细胞因子IL-12分泌增多，混合淋巴细胞反应显示经HBV S-ecdCD40L诱导的DC刺激T淋巴细胞增殖能力提高。

有研究[5]表明，TLR4识别配体后，可通过髓样分化因子 88（MyD88）依赖和非依赖两种信号转导途径，激活NF-κ B和MAPK，引起多种细胞因子的释放，上调DC表面CD80、CD86等共刺激分子，并最终激活特异性免疫系统。我们在本实验中发现PBS组的TLR4表达较低，经pcDNA3.1-S-ecdCD40L刺激后DC表面TLR4的表达较pcDNA3.1组和PBS组显著增多，提示该疫苗可增加TLR4表达，从而促使机体清除病毒。推测TLR4很可能在HBV转基因小鼠DC成熟中起到重要作用，这有待以后更加深入的研究。

总之，由pcDNA3.1-S-ecdCD40L介导的HBV S-

ecdCD40L表达能有效促进HBV转基因小鼠DC成熟，在将来可能成为治疗HBV感染的新方法。

[1]林贤凡, 吴金明, 陈瑾, 等. 乙肝表面抗原-CD40L胞外段融合蛋白的设计和生物活性预测[J]. 温州医学院学报, 2009, 39 (3): 205-208.

[2]Lu L, Woo J, Rao AS, et al. Propagation of dendritic cell progenitors from normal mouse liver using granulocyte/macrophage colony-stimulating factor and their maturational development in the presence of type-1 collagen[J]. J Exp Med, 1994, 179(6): 1823-1834.

[3]王少林, 林玉梅, 马卫闽, 等. HBcAg/HBeAg对慢性乙型肝炎患者PBMC中Th1/Th2类细胞应答的影响[J]. 免疫学杂志, 2000, 16(6): 451-453.

[4]Wu JM, Lin XF, Huang ZM, et al. Construction of the HBV S-ecdCD40L fusion gene and effects of HBV S-ecdCD40L modication on function of dendritic cells[J]. J Viral Hepat, 2011, 18(10): 461-467.

[5]Akira S, Takeda K. Toll-like receptor signaling[J]. Nat Rev Immunol, 2004, 7(4): 499-511.

（本文编辑：丁敏娇）

Effects of HBV S-ecdCD40L on phenotype and function of dendritic cells from hepatitis B virus genome transgenic mouse

WU Wenzhi, XU Ying, WU Jinming, ZHANG Huan.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015

Objective:To examine the influence of expression of HBV S-ecdCD40L on the maturity differentiation and function of the dendritic cells (DC) from hepatitis B virus (HBV) genome transgenic mouse models, and to explain the possible mechanism.Methods:HBV transgenic mice were injected with pcDNA3.1-S-ecdCD40L, pcDNA3.1-S, pcDNA3.1 and PBS respectively, (each 100 μg/25 g). Vaccination was performed on, day 15 and day 30. Six weeks after first injection sera were collected. Isolate DC and examine the phenotypic and functional changes, and the HBV DNA copies in HBV transgenic mice serum were detected by real-time PCR.Results:Compared with other three control groups, DC from injection with pcDNA3.1-S-ecdCD40L mice enhanced expression of costimulatory molecules (CD80, CD86, MHC II), Tollrike receptor 4 (TLR4), proinflammatory cytokine (IL-12p70) and also the capacity to induce allogeneic lymphocytes proliferation. And the average copies of serum HBV DNA were lower than those of the other three control groups. Conclution: The study in vivo supports the concept that the recombinant plasmids pcDNA 3.1-S-ecdCD40L-mediated HBV S-ecdCD40L expression may be a useful strategy for activating DC’s maturity and enhancing its functions.

hepatitis B virus; dendritic cell; Toll like receptor; mice

R512.6

A

1000-2138（2014）04-0248-04

2013-02-25

浙江省自然科学基金资助项目（Y2110768，Y12H 030023）；温州市科技局科研基金资助项目（Y20100204）。

吴文治（1977-），男，湖北武汉人，主治医师，硕士。

吴金明，教授，主任医师，Email：wujm0516@ yahoo.com.cn。