介入化疗前后宫颈癌组织pS53及pS642表达及意义

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(1 青岛大学附属医院妇科，山东 青岛 266003； 2 青岛市市北区人民医院检验科)

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，主要治疗方法是手术、放疗及化疗。化疗主要用于中晚期病人，近年来术前新辅助化疗(动脉栓塞化疗)广泛应用于临床，提高了手术切除率，改善了预后。细胞有丝分裂抑制酶Wee1是细胞周期调控的一种关键激酶，与肿瘤的发生相关。Wee1第53及642位点丝氨酸磷酸化蛋白(pS53、pS642)在Wee1的失活与激活过程中起重要作用。本实验采用免疫组织化学法检测动脉栓塞化疗前后宫颈癌组织中pS53及pS642的表达，研究两种蛋白的表达变化及其与临床治疗效果的相关性，并探讨动脉栓塞化疗对细胞周期调控的影响，以期为判定动脉栓塞化疗的疗效 提供客观的依据。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料来源

所有标本均取自2009年6月—2012年10月我院活检或手术切除的宫颈组织蜡块。其中宫颈癌病人50例，正常宫颈病人40例。病理检查前未进行放射等治疗。宫颈癌病人年龄36～68岁，中位年龄45.3岁。所取得标本均经病理检查确诊为宫颈癌，且均为鳞癌。病人经动脉栓塞化疗2～3周后行广泛性子宫切除加盆腔淋巴结清扫术，按2009年国际妇产科联盟(FIGO)分期：ⅠB期25例，ⅡA期15例，ⅡB期10例。按组织分化程度分类：高分化15例，中分化30例，低分化5例。正常宫颈病人年 龄40～65岁，中位年龄46.4岁。标本来源于宫颈活检及子宫肌瘤、子宫腺肌病等子宫良性病变行子宫切除的宫颈组织。两组病人年龄比较差异无显著性(P>0.05)。

1.2 试剂

兔抗人pS53蛋白多克隆抗体、兔抗人pS642蛋白单克隆抗体、即用型快捷免疫组织化学MaxvisionTM2试剂盒(鼠-兔)二抗及液体DAB酶底物显色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组化方法检测

将蜡块置于石蜡切片机，连续4 μm厚切片，制成标本后进行免疫组化染色。切片依次行脱蜡水化、抗原修复、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、苏木精复染、脱水及中性树胶封片。

1.4 结果判断

pS53蛋白主要定位于细胞核中，偶尔在细胞浆中有少量染色；pS642蛋白主要定位于细胞浆中，细胞核中亦可有少量染色。切片染色后，在高倍视野下，随机选取5个视野计算阳性细胞率。其阳性结果判断参照SINICROPE等[1]的半定量积分法。以阳性细胞率≤5%为1分，6%～25%为2分，26%～50%为3分，51%～75%为4分，>75%为5分；染色无色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分。阳性细胞率评分与染色强度评分乘积≥3分为阳性。

2 结 果

2.1 正常宫颈组织、动脉栓塞化疗前后宫颈癌组织中pS53及pS642的表达

正常宫颈组织中pS53及pS642阳性表达率分别为15%(6/40)、40%(16/40)，动脉栓塞化疗前宫颈癌组织中两者阳性表达率分别为84%(42/50)、92%(46/50)，组间比较差异有显著性(χ2=42.50、28.10，P<0.01)。动脉栓塞化疗后宫颈癌组织中pS53及pS642阳性表达率为44%(22/50)和52%(26/50)，较动脉栓塞化疗前明显下降，差异有显著性(χ2=17.36、19.84，P<0.01)。不同临床分期、组织分化程度动脉栓塞化疗前后宫颈癌组织pS53、pS642表达差异无显著性(P>0.05)。见表1。

2.2 动脉栓塞化疗前后宫颈癌组织中pS53及pS642表达变化与临床疗效的关系

动脉栓塞化疗后pS53上升者3例，有效率为0；pS53无变化者25例，有效率为88%；pS53下降者22例，有效率为100%。pS642上升者2例，有效率为0；pS642无变化者15例，有效率为73.3%；pS642下降33例，有效率为100%。pS53及pS642在动脉栓塞化疗前后表达变化与临床疗效呈负相关，差异有显著性(r=-0.328、-0.456，P<0.01)。

表1介入化疗前后宫颈癌组织pS53、pS642表达与临床病理特征关系(例)

临床病理特征npS53化疗前化疗后pS642化疗前化疗后临床分期5042224626 ⅠB期2520122215 ⅡA期15137147 ⅡB期1093104组织分化 高分化15117128 中分化3026132916 低分化55252

3 讨 论

3.1 Wee1的表达及意义

Wee1蛋白激酶是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族的一员[2]。Cdc2作为细胞进入有丝分裂的关键调节因子，其第15位上的酪氨酸可被Wee1磷酸化，而使Cdc2-CyclinB复合物失活[3]，使细胞停滞在细胞间期进行检测和修复。随后，细胞进入G2/M期，Wee1降解，细胞通过G2/M期的检测点，完成增殖。在细胞增殖的过程中，如果Wee1表达出现异常，细胞或于间期停滞而凋亡，或变异后通过G2/M期检测而发生癌变。Wee1一方面可通过磷酸化Cdc2阻止异常有丝分裂发生，另一方面其自身的某些位点也可发生磷酸化，调节细胞增殖过程。例如Wee1的丝氨酸第642位点(Ser642)发生磷酸化后与14-3-3蛋白结合，能促使Wee1活化，维持Cdc2-CyclinB复合物失活，使细胞在间期进行检测和修复。KATAYAMAK等[4]通过实验证明，将Ser642位点的丝氨酸突变为丙氨酸后，Wee1的Ser642位点不能被磷酸化，而14-3-3蛋白主要通过磷酸化依赖的方式与靶蛋白结合来发挥调控作用，Wee1失去与14-3-3蛋白结合的能力，从而使Wee1失活，细胞增殖发生异常。这说明与14-3-3蛋白的结合需要Wee1 Ser642位点磷酸化，进而说明Wee1的磷酸化活性调节位点位于Ser642。

Wee1蛋白激酶在M期的降解是泛素依赖的降解，它的泛素化连接酶是β-TrCP-containing SCF复合物。Wee1的Ser53能够与β-TrCP复合物特异性结合并发生磷酸化，从而使Wee1发生降解[5]。Wee1的降解在Cdc2激活中起重要作用[6]，而Cdc2

的激活是恢复因检查修复DNA损伤点而停止的细胞周期所必需的。因此，Wee1的Ser53位点磷酸化对于细胞增殖顺利进行起重要作用。

3.2 pS53及pS642的表达在宫颈癌动脉栓塞化疗中的意义

本研究通过免疫组化染色方法检测显示，pS53及pS642两种蛋白均在宫颈癌组织中高表达，在正常宫颈组织中低表达，而且其表达的变化与动脉栓塞化疗的效果呈负相关。Wee1调控细胞通过G2/M期检测点。当DNA复制异常时，Wee1可以阻止有丝分裂继续进行，DNA完全修复后重新启动有丝分裂，以保持DNA的完整性。pS53及pS642在Wee1的活化与降解中起巨大作用。顺铂属细胞周期非特异性细胞毒性药物，在细胞内可迅速解离，以水合阳离子的形式与细胞内DNA结合形成链间、链内或蛋白质DNA交链，从而破坏DNA的结构和功能。博来霉素抑制胸腺嘧啶核苷嵌入DNA，引起DNA单链和双链断裂，作用于增殖细胞周期的S期。在动脉栓塞化疗后pS53及pS642的表达明显受到抑制，从而推测其与在细胞周期中化疗药物引起DNA的破坏、影响Wee1的稳定性有关。Wee1降解异常，从而细胞越过DNA复制检测点进入有丝分裂期，进行异常增殖。

有研究显示，在某些癌组织中Wee1的表达高于其在正常组织中的表达[7]。本研究结果提示，动脉栓塞化疗的有效性和pS53、pS642的表达相关，但Wee1和pS53、pS642在动脉栓塞化疗过程中的具体作用机制尚需要进一步研究。目前对于细胞增殖的研究表明，Wee1抑制剂能抑制宫颈癌细胞株HeLa细胞的增殖，因此，我们可利用其在细胞周期中G1期的缺陷[8]，运用siRNA转染法将Wee1抑制剂作用于肿瘤细胞，可抑制肿瘤细胞的生长和增殖。因此，Wee1抑制剂可作为抗肿瘤的分子药物。研究显示，Wee1抑制剂还可协同其他抗肿瘤药物共同发挥作用。例如通过siRNA转染法将Wee1抑制剂作用于肿瘤细胞后，Wee1失活，这时肿瘤细胞更容易被其他化疗药物，例如多柔比星杀死，同时正常细胞损伤不明显。Wee1抑制剂(如MK-1775)亦可单一或与吉西他滨、卡铂、顺铂等化疗药物合用治疗进展期的实体肿瘤。因此，我们可以期待在不久的将来，临床上与Wee1及pS53、pS642相关药物的广泛应用能够为宫颈癌病人的治疗提供更多、更好的手段。

[参考文献]

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[3]NAKAJIMA H, YONEMURA S, MURATA M, et al. Mytl protein kinase is essential foe Golgi and ER assembly during mitoticexit[J]. J Cell Biol, 2008,181(1):89-103.

[4]KATAYAMA K, FUJITA N, TSURUO T. Akt/protein kinase B-dependent phosphorylation and inactivation of WEE1Hu promote cell cycle progression at G2/M transition[J]. Mol Cell Biol, 2005,25:5725-5737.

[5]WATANABE N, ARAI H, NISHIHARA Y, et al. M-phase kinases induce phosphodependent ubiquitination of somatic Weel by SCFbeta-TrCP [J]. ProcNatl Acad Sci USA, 2004,101(13):4419-4424.

[6]COLEMAN T R, DUNPHY W G. Cdc2 regulatory factors[J]. Current Opinion in Cell Biology, 1994,6(6):877-82.

[7]张金敏,王翔宇,李南,等. PB方案在宫颈癌介入化疗中的疗效观察及对 Wee1表达的影响[J]. 现代生物医学进展, 2014,9:1719-1723.

[8]IORNS E, LORD C J, GRIGORIADIS A, et al. integrated functional, gene expression and genomic analysis for the identifiecation of cancer targets[J]. PLoS One, 2009,4(4):e5120.