As2O3对人胃癌多药耐药细胞模型的逆转耐药作用

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(青岛大学医学院附属医院肿瘤科，山东 青岛 266003)

胃癌的早期症状不易被发现，近80%的病人发现时已为晚期，只能接受全身化疗维持或延长生命。而化疗因为严重的副作用及多药耐药的产生并不能明显提高生存率[1-3]。目前，多药耐药成为临床癌症病人化疗失败的主要原因。三氧化二砷(As2O3)已有2 000多年的应用历史，目前主要用于治疗急性早幼粒细胞白血病。近期研究显示，As2O3能够增强肿瘤细胞化疗敏感性[4]。本课题组以往研究结果显示，As2O3对胃癌耐药细胞具有耐药逆转及诱导凋亡作用[5]。目前，关于胃癌多药耐药细胞株模型的建立及其对多种化疗药物交叉耐药方面的研究鲜有报道。本研究旨在应用阿霉素(ADM)短期诱导建立人胃癌多药耐药细胞株，探讨胃癌多药耐药机制及As2O3对其逆转耐药的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人胃癌亲本细胞系(SGC7901/S)，由我院实验中心惠赠。RPMI 1640，GIBCO公司；标准胎牛血清，杭州四季青生物材料研究所；As2O3，北京双鹭药业有限公司；ADM,浙江海正药业股份有限公司；长春新碱(VCR)，上海医药集团；紫杉醇(TAX)，北京协和制药；鼠抗人P-糖蛋白(P-gp)、Caspase3单克隆抗体及免疫组织化学试剂盒，北京中杉生物技术有限公司；凋亡试剂盒，Invitrogen公司。

1.2 实验方法

1.2.1耐药细胞株的建立 取对数生长期的敏感细胞株SGC7901/S，以ADM浓度梯度递增法诱导细胞耐药性。ADM初始浓度为0.01 mg/L，作用24 h后使用PBS洗涤5次，换用新鲜正常培养液继续培养，待细胞生长稳定后，继续递增ADM的浓度至0.02 mg/L。依此方法，逐渐增加ADM的浓度，最终浓度达到0.60 mg/L，获得多药耐药胃癌细胞株SGC7901/ADM，以ADM浓度0.20 mg/L培养基维持培养。待细胞生长稳定，取对数生长期细胞进行观察，PBS冲洗2次，更换新鲜培养液，将培养瓶置于倒置显微镜下观察细胞形态。

1.2.2MTT法体外药物敏感试验 调整细胞密度为2×108/L，然后分别将两种细胞(SGC7901/S和SGC7901/ADM)接种于96孔板(每孔200 μL)培养过夜，待细胞贴壁生长稳定，加入梯度浓度的化疗药物ADM(0～40.0 mg/L)、TAX(0～50.0 mg/L)和VCR(0～20.0 mg/L)，每个剂量设3个复孔，孵育48 h后每孔加入MTT液10 μL，继续孵育4 h，弃上清后每孔加入DMSO 150 μL，震荡混匀，全自动酶标仪(AR 2010型)测定每孔490 nm处吸光度(A)值，确定3种药物对两细胞株生长抑制50%时的浓度(IC50)，分别计算两种细胞耐药倍数(RI，RI=耐药细胞IC50/敏感细胞IC50)。确定As2O3的无毒剂量和低毒剂量分别为0.1和0.5 μmol/L。将实验分为SGC7901/ADM+化疗药物+As2O30.1 μmoL/L组(实验1组)、SGC7901/ADM+化疗药物+As2O30.5 μmol/L组(实验2组)、SGC7901/ADM+化疗药物组(阴性对照2组)、SGC7901/S+化疗药物组(阴性对照1组)及SGC7901/ADM+化疗药物+环孢素A(CsA)4 mg/L组(阳性对照组)，分别进行相应处理，每组均作用48 h。 MTT法测定各组细胞的IC50,As2O3及CsA作用后SGC7901/ADM细胞的耐药倍数(RI′)，逆转耐药倍数=RI/RI′。

1.2.3免疫组化法检测P-gp、Caspase3表达 将SGC7901/ADM和SGC7901/S细胞以2×108/L密度接种于装有载玻片的无菌培养皿，孵育12 h，待细胞贴壁后分组进行实验，分组及处理方法同1.2.2。实验重复3次，分别作用48 h收取载玻片。40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，体积分数0.03的H2O2-甲醇溶液作用10 min，两次处理后均使用PBS持续冲洗3 min。载玻片上分别滴加P-gp和Caspase3一抗，37 ℃孵育1 h。用PBS洗涤后，集合物辅助剂作用15 min，加入辣根酶标记的二抗作用30 min，DAB显色2 min，苏木精复染2 min。每张载玻片选择3个不同视野，使用VIDAS图像分析仪对染色进行绝对灰度定量分析。

1.2.4流式细胞仪测定细胞凋亡率 将SGC7901/ADM细胞培养于6孔板中(2×108/L)，分别以0.1和0.5 μmoL/L的As2O3、4 mg/L的CsA作用24 h及48 h后收获细胞。采用冷PBS洗涤离心后，取100 μL细胞悬液，加入5 μL的annexinV和1 μL的PI(100 mg/L)，室温作用15 min，加入400 μL预冷处理的缓冲液后上流式细胞仪(B.D.Vantage型，美国)检测细胞凋亡率，每组重复3次。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 显微镜下细胞形态

SGC7901/S细胞经ADM诱导后，大部分因死亡而悬浮，剩余贴壁细胞每次药物作用后第2～4天开始体积逐渐变大，形态不规则，胞浆中有空泡和颗粒形成，核仁变大并多个，撤药后贴壁细胞开始呈铺路石样成簇生长，逐渐恢复稳定，至贴满瓶壁。

2.2 两种细胞对抗癌药物的敏感性比较

SGC7901/ADM细胞(阴性对照2组)对3种抗癌药物ADM、TAX、VCR的IC50均高于SGC7901/S细胞(阴性对照1组)，差异有显著性(F=7.795～12.499，q=5.78～6.15,P<0.05)，SGC7901/ADM细胞对ADM、TAX及VCR表现出交叉耐药性，耐药倍数分别为7.49、7.56、5.33。见表1。

2.3 As2O3干预前后SGC7901/ADM细胞对3种抗癌药物的IC50

经药物干预48 h后，实验1组、实验2组及阳性对照组对ADM、TAX和VCR的IC50均较阴性对照1组、阴性对照2组降低，差异有显著意义(F=169.766～1 199.812，q=6.86～70.40,P<0.01)。其中实验2组IC50明显低于实验1组，提示As2O3逆转耐药能力存在剂量依赖性。见表1。

2.4 As2O3作用前后SGC7901/ADM细胞内P-gp和Caspase3表达比较

免疫组化染色显示，P-gp蛋白阳性染色表现为棕色颗粒，主要定位于细胞膜，部分定位于细胞浆。SGC7901/ADM细胞中棕色颗粒较SGC7901/S细胞明显增多。实验1、2组及阳性对照组中P-gp表达量较阴性对照2组明显减少，差异有显著性(F=42.870，q=7.70～21.50，P<0.01)，其中，阳性对照组P-gp表达减少最明显。Caspase3阳性染色表现为浅棕色颗粒，主要位于核膜，两细胞株均表达较少；实验2组中Caspase3表达较阴性对照2组增多，差异有显著性(F=7.22，q=6.63，P<0.05)；其他组比较差异无显著性(P>0.05)。见表2。

2.5 各组细胞凋亡率比较

以0.1、0.5 μmoL/L剂量的As2O3作用48 h，凋亡率均较SGC7901/ADM组升高，差异有显著意义(F=1 986.63，q=21.23～95.08，P<0.05)；而作用24 h仅0.5 μmoL/L剂量组凋亡率升高，差异有统计学意义(F=859，q=60.37，P<0.05)。CsA作用组24 h及48 h凋亡率与SGC7901/ADM组比较，无统计学差异(P>0.05)。见表3。

组别IC50(ρ/mg·L-1)ADMTAXVCRRI′ADMTAXVCR阴性对照1组3.93±0.521.85±0.111.16±0.05阴性对照2组29.44±0.5514.00±0.606.18±0.51 7.49∗ 7.56∗ 5.33∗实验1组16.22±0.8410.05±0.224.92±0.254.785.434.24实验2组3.02±0.602.38±0.131.62±0.270.771.291.40阳性对照组4.45±0.402.20±0.071.36±0.141.131.191.17

注：*为RI。

表2 各组细胞P-gp和Caspase3表达比较

组别24 h48 hSGC7901/ADM组0.46±0.020.61±0.07As2O3作用组 0.1 μmoL/L剂量组0.51±0.055.45±0.16 0.5 μmoL/L剂量组1.68±0.0522.45±0.66CsA作用组0.52±0.041.43±0.11

3 讨 论

胃癌细胞产生多药耐药的机制复杂，是肿瘤细胞在生存“压力”下通过多种基因、多种信号途径调控适应的结果[6]。P-gp是一种经典的MDR耐药蛋白，它能够将进入到细胞内的抗肿瘤药物排除到细胞外，使细胞内的毒性药物浓度降低而表现为抗药性，从而实现肿瘤细胞自我保护[7]。另外，P-gp能阻遏多种因素对细胞凋亡诱导，包括Caspase依赖性凋亡、半胱天冬酶依赖性凋亡、细胞毒类药物等。研究显示，Casepase是细胞发生凋亡的主要因素，其中Caspase3是触发凋亡级联反应的效应酶，最终激活DNA酶水解DNA，导致细胞凋亡，并且目前被证实在细胞抗药性方面有着重要的应用潜能[8]。

As2O3是从中国传统中药砒霜中分离出来的成分，在低浓度下对人体具有有益作用，如刺激造血功能，目前被广泛用于抗癌治疗[9]。体外研究结果表明，As2O3并不改变P-gp的表达也不能被其转运代谢，可能原因是As2O3与P-gp没有直接的关系。As2O3对包括胃癌在内的多种实体瘤具有诱导凋亡和部分分化效应，动物实验表明，它能够增加移植瘤组织Caspase3的表达量，并且与其抗肿瘤作用相关[10]。As2O3能够通过下调P-gp表达，从而与传统化疗药物ADM具有协同作用；同时能通过上调P53表达、激活Caspase3诱导人胃癌细胞凋亡。

ADM是一种经典的抗癌药物，广泛应用于临床，能够抑制DNA和RNA的合成[11]，是引起肿瘤细胞耐药P-gp机制最主要的底物。P-gp能使细胞对亲脂类的抗癌药物不敏感，如抗生素类、生物碱类及植物类，而对烷化剂及抗代谢类药物则不起作用[12]。本研究选用ADM浓度梯度递增法诱导建立耐药细胞株SGC7901/ADM，MTT法检测显示，SGC7901/ADM同时对ADM、TAX、VCR产生了低倍数耐药，经As2O3作用后对3种抗癌药物的IC50下调，说明由单纯一种抗癌药物诱导所得耐药细胞具有交叉耐药性，所发生的耐药机制又能被As2O3阻遏而逆转。 SGC7901/ADM经低毒剂量As2O3作用后，P-gp蛋白表达明显下调，但仍高于敏感细胞SGC7901/S，低毒剂量组IC50接近于敏感细胞，提示As2O3逆转耐药机制除下调耐药蛋白外，还可能通过其他多种机制，如增加Caspase3表达的诱导凋亡、与化疗药物协同的细胞毒作用等，Caspase3相应增多及凋亡率升高也证明这一点。

综上所述，单纯化疗药ADM能够成功诱导多药耐药胃癌细胞株SGC7901/ADM建立，并且对其他抗癌药物具有交叉耐药现象，存在耐药蛋白P-gp表达的上调；As2O3逆转P-gp表达同时，有依赖Caspase3凋亡途径的参与。

本文耐药细胞模型的建立为以后研究耐药机制及寻求逆转剂提供便利。

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