沉默ATF5对卵巢癌裸鼠成瘤的影响

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(青岛大学医学院，山东 青岛 266003 1 附属医院妇科； 2 微生物学教研室)

人转录激活因子5(ATF5)在卵巢癌组织中高表达，并特异性地促进肿瘤细胞存活，而抑制其功能，可诱导卵巢癌细胞凋亡[1]。本次实验通过RNA干扰抑制ATF5的表达，形成ATF5功能缺失的肿瘤细胞，再将细胞接种至裸鼠皮下观察成瘤情况，了解在细胞水平抑制ATF5功能后对卵巢癌生物学 行为的影响，初步探讨将ATF5作为靶基因对卵巢癌进行基因治疗的可能性。

1 材料和方法

1.1 材料来源

人卵巢癌细胞株SKOV-3购于中国科学院上海细胞库。4～6周龄BALB/c/nu雌性裸鼠(体质量为18～20 g)购于北京维通利华实验动物技术有限公司，于青岛大学病原生物学重点实验室SPF条件下饲养。

1.2 仪器及试剂

McCoY′5A培养基、二甲基亚枫、四甲基偶氮唑蓝(美国Sigma公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)；罗氏TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(美国Roche公司)；DNA Marker(日本Takara公司)；兔抗人ATF5多克隆抗体(英国Abcam公司)；小鼠抗人β-actin 单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)；HRP标记的山羊抗小鼠IgG及山羊抗兔IgG(北京博奥森生物技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1扩增引物设计 在基因序列数据库中检索ATF5、β-actin基因的mRNA序列，通过比对，并用Primer5软件设计特异性扩增引物，交由上海生工生物工程有限公司合成。将合成的引物送交上海吉凯基因化学技术有限公司进行慢病毒包装。

1.3.2细胞培养 将SKOV-3细胞培养于含有体积分数0.10胎牛血清的McCoY′5A培养液中，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2培养箱中培养。

1.3.3细胞转染 取对数生长期的细胞，接种于6孔板中，每孔2×106个细胞，分为空白对照组、空载体对照组和实验组，待细胞融合到50%～70%时，空白对照组更换新鲜培养液2 mL；空载体对照组加入携带非特异性质粒的病毒液100 μL，polybrene 100 μL(终浓度为5 mg/L)及新鲜培养液1.8 mL；实验组加入携带特异性干扰质粒的病毒液100 μL，polybrene 100 μL(终浓度为5 mg/L)及新鲜培养液1.8 mL；常规培养8 h后更换培养液,培养3～5 d观察荧光。

1.3.4MTT法检测体外细胞增殖状态 细胞密度调至1×108/L,分别取空白对照组、空载体对照组、特异性转染的实验组细胞悬液100 μL接种于96孔板，每组细胞设4个复孔，常规培养1～5 d，每天观察细胞生长状态。培养结束前4 h，每孔加入MTT溶液(5 g/L，用PBS配制成pH 7.4)20 μL，继续孵育4 h。终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加DMSO 150 μL，振荡10 min，在酶联免疫监测仪上测定各孔在波长 490 nm处吸光度(A)值。

1.3.5TUNEL法检测体外细胞凋亡状态 将玻片高压灭菌后放入24孔培养板中，调细胞密度至5×108/L,分别取3组细胞悬液500 μL,接种于24孔板中的盖玻片上，待细胞融合达60%～80%时，利用罗氏TUNEL检测试剂盒检测细胞凋亡情况。

1.3.6荷瘤小鼠模型的建立及成瘤率观察 将裸鼠随机分为3组，空白对照组、空载体对照组及实验组，每组5只小鼠。分别取对数生长期细胞5×106个，每只裸鼠右侧腋下注射[2]。每天对比观察裸鼠及肿瘤生长情况。接种后4周末脱颈处死，完整剥离肿瘤，称取瘤质量，并计算移植瘤体积[3]。

1.3.7荷瘤小鼠肿瘤组织形态学观察 取出瘤组织观察其表面形态；取部分瘤组织置40 g/L甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋、切片后苏木精-伊红(HE)染色观察；另一部分瘤组织于-80 ℃冰箱冻存，进行分子生物学指标的检测。

1.3.8RT-PCR方法检测ATF5 mRNA表达水平将-80 ℃冻存的肿瘤组织用Trizol试剂提取其总RNA，计算RNA浓度。取3 μg总RNA，进行逆转录，扩增产物于10 g/L的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像系统拍照，Quantity One软件进行灰度分析。

1.3.9Western-Blot方法检测肿瘤组织ATF5蛋白的表达 取-80 ℃冻存的肿瘤组织，液氮研磨，蛋白裂解液裂解，测定蛋白含量后进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，转膜，一抗、二抗孵育，化学发光，UVP凝胶成像系统拍照，以β-actin为内参照,实验重复3次，实验结果取均值。

2 结 果

2.1 质粒转染SKOV-3细胞情况及转染效率

慢病毒携带的质粒均带红色荧光蛋白基因，转染成功后在绿光激发下荧光显微镜观察可见红色荧光。根据不同复感染指数 (MOI)，确定最佳MOI为1∶40。荧光显微镜下观察显示，质粒转染第3天开始出现荧光，转染后第5天在同一视野下的荧光图像及明视野图像显示，70%以上细胞出现荧光(图1)，结果表明慢病毒携带的质粒成功转染卵巢癌SKOV-3细胞。

2.2 MTT法检测各组细胞体外生长增殖情况

与实验组比较，空白对照组和空载体对照组细胞均具典型形态，折光性、贴壁状况良好；3组在相同培养时间SKOV-3细胞增殖情况比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

2.3 各组细胞体外生长凋亡状况

如图2所示，实验组凋亡细胞数量明显多于空白对照组和空载体对照组，空白对照组和空载体对照组间细胞凋亡数量比较差异不明显，说明靶向沉默ATF5可促进卵巢癌SKOV-3细胞的凋亡。

2.4 沉默ATF5对裸鼠体内成瘤的影响

接种肿瘤细胞后第3天，空白对照组和空载体对照组皮下全部成瘤，实验组较其他两组成瘤时间晚。实验4周末，实验组、空白对照组和空载体对照组肿瘤体积分别为(970.85±49.30)、(2 500.66±97.97)、(2 475.87±91.03)mm3，实验组肿瘤体积明显小于对照组(F=2.21，P<0.05)，空白对照组和空载体对照组比较差异无显著统计学意义(P>0.05)。实验组、空白对照组和空载体对照组肿瘤质量分别为(1.26±0.18)、(2.53±0.28)、(2.53±0.28)g，实验组肿瘤质量明显小于对照组，差异有显著性(F=4.01，P<0.05)，空白对照组和空载体对照组比较差异无显著统计学意义(P>0.05)。

2.5 荷瘤小鼠肿瘤组织的形态学观察

各组移植瘤无明显周围组织浸润现象，易分离。HE染色显示，空白对照组和空载体对照组镜下瘤组织细胞密集，胞质丰富，胞核大而深染，异型性明显，核分裂象多见。实验组瘤细胞数目相对稀少，胞核较小，胞质少，核分裂象少见(图3)。

A为实验组荧光显微镜下红色荧光蛋白表达情况；B为实验组光镜下细胞形态；C为空载体对照组荧光显微镜下红色荧光蛋白表达情况；D为空载体对照组光镜下细胞形态。

图1质粒转染后细胞内绿色荧光蛋白表达情况

A：空白对照组光学显微镜下细胞凋亡情况；B：空载体对照组光学显微镜下细胞凋亡情况；C：实验组光学显微镜下细胞凋亡情况。100倍。

图2罗氏TUNEL检测试剂盒检测细胞凋亡情况

A：空白对照组光学显微镜下细胞形态；B：空载体对照组光学显微镜下细胞形态；C：实验组光学显微镜下细胞形态。HE染色，400倍。

图3各组肿瘤组织的形态学变化

2.6 各组肿瘤组织中ATF5 mRNA的表达

空白对照组、空载体对照组与实验组肿瘤组织ATF5 mRNA与内参β-actin的比值分别为0.79±0.08、0.75±0.19、0.55±0.14，空白对照组比值最高，与空载体对照组相比差异无显著性，与实验组相比差异有显著性(F=4.01，P<0.05)。Western-Blot方法检测3种肿瘤组织中ATF5蛋白的表达，结果与RT-PCR结果一致。见图4。

A为RT-PCR检测3组移植瘤组织ATF5 mRNA表达：M为Marker；①～③为空白对照组、空载体对照组及实验组移植瘤组织β-actin mRNA表达；④～⑥为移植瘤组织ATF5 mRNA表达；B为Western-Blot方法检测3组移植瘤组织ATF5蛋白表达。

图4各组肿瘤组织中ATF5mRNA的表达情况

3 讨 论

卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，癌细胞扩散途径广泛，在妇科恶性肿瘤中其死亡率高居首位[4]，严重威胁女性的生命健康。RNA干扰可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，而阻断之后相应的细胞就可表达出这种基因缺失的表型[5]。小干扰RNA(siRNA)是RNA干扰的效应分子，体外合成siRNA则是RNA干扰技术的最新发展，尤其在特异性抑制哺乳动物细胞基因方面，为基因治疗开创了新的途径[6]。

ATF5是激活转录-cAMP家族成员之一，其C端含有碱性亮氨酸拉链特异性结构域，在细胞凋亡、分化和发育等生理过程中发挥重要作用[7-8]，是一种与凋亡密切相关的转录因子。已有研究结果显示，在上皮性卵巢癌组织中ATF5高表达，其蛋白表达与卵巢癌临床分期和组织分化程度有关，与肿瘤组织分型无明显相关性，说明ATF5与卵巢癌发生、发展密切相关[1]。由此推测，将ATF5干扰基因导入卵巢癌细胞，可能对提高机体抗瘤效应有一定的应用价值。

本文的研究结果显示，携带特异性ATF5干扰基因的质粒可成功转染并诱导卵巢癌SKOV-3细胞的凋亡，其生长增殖水平与空白对照组和空载体对照组无明显差异，细胞的形态未见明显变化。体内荷瘤实验结果显示，有特异性质粒干扰实验组裸鼠的肿瘤生长速度、体积及质量均明显低于空白对照组和空载体对照组，且瘤组织中均存在ATF5表达，表达较其他两组弱；光学显微镜下分裂象较其他两组明显减少。上述研究结果证实，沉默ATF5基因有可能达到促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤生长的目的，ATF5值得作为卵巢癌基因治疗的重要候选基因之一。

[参考文献]

[1]芦进荣,钱冬萌,齐亚妮,等. 上皮性卵巢癌组织中ATF5基因的表达及其临床意义[J]. 中国肿瘤临床, 2012,39(4):205-207,211.

[2]冯翠萍,高美华. CD59-siRNA对人卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的作用[J]. 青岛大学医学院学报, 2010,46(4):289-291.

[3]魏伟,吴希梅,李元建. 药理实验方法学[M]. 4版. 北京:人民卫生出版社, 2010:1619-1620.

[4]乐杰. 妇产科学[M]. 5版. 北京:人民卫生出版社, 2000:339.

[5]ZAMORE P D, TUSCHL T, SHARP P A, et al. RNAi: double-stranded BNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals[J]. Cell, 2000,101(1):25-33.

[6]王明明,葛银林,欧阳奇琦,等. siRNA沉默血管VEGFR-1基因对乳癌生长抑制作用[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(4):292-294.

[7]HAI T, HARTMAN M G. The molecular biology and nomenclature of the activating transcription factor/cAMP responsive element binding family of transcription factors: activating transcription factor proteins and homeostasis[J]. Gene, 2001,273(1):1-11.

[8]PERSENGIEV S P, GREEN M R. The role of ATF/CREB family members in cell growth, survival and apoptosis[J]. Apoptosis, 2003,8(3):225-228.