大鼠肺缺血再灌注组织microRNA-451与蛋白激酶B表达

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(青岛大学医学院附属医院，山东 青岛 266003 1 胸外科； 2 中心实验室)

microRNA-451是长约22 nt的内源性非编码小分子RNA，通过作用于靶mRNA使其降解或抑制其转录后翻译，从而调控基因表达、细胞周期以及细胞的增殖与坏死[1]。蛋白激酶B(P-AKT)是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，活化的AKT通过磷酸化下游的许多靶蛋白，发挥其生物学活性，可以调节基因的转录、翻译以及翻译后加工，从而调节细胞周期，抑制细胞凋亡。肺移植已成为各种终末期肺部疾病的重要治疗手段，而缺血再灌注损伤是影响肺移植成功率的最大制约因素[2]。近年来，随着micro-RNA及其下游调节机制影响肿瘤细胞增殖的研究不断深入，其在缺血再灌注损伤中的作用也越来越受到关注，但在肺缺血再灌注过程中，microRNA及其下游调节蛋白的表达变化尚少有报道。基因芯片技术研究结果显示，缺血肺组织中microRNA-451的表达量上调2倍以上[3]。本实验应用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)及Western blot方法，检测缺血再灌肺组织中microRNA-451及p-AKT蛋白的表达情况。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

健康清洁级雄性Wistar大鼠50只，体质量为250～300 g，均购自山东鲁抗医药公司实验动物中心；PrimeScript®RT reagent Kit及Premix Ex TaqTM，均购自大连宝生物工程有限公司；TaqMan®MicroRNA Assay Kit，购自Applied Biosystems公司；兔抗大鼠GAPDH单克隆抗体和山羊抗兔单克隆抗体，均购自康维世纪公司；兔抗大鼠p-AKT多 克隆抗体，购自 Santa Cruz公司。

1.2 实验方法

Wistar大鼠50只，随机分为对照组、缺血组、再灌注1 h组、再灌注3 h组、再灌注6 h组，每组10只大鼠。麻醉大鼠，行气管插管后接呼吸机，仰卧位固定大鼠，于胸骨左侧第5肋间进胸，松解下肺韧带，游离出肺门根部，手术中注意保护肺组织，避免组织损伤。予100 U肝素静注，5 min后(肺中度膨胀时)，于肺门处用血管夹阻断血流，手术后碘附水冲洗胸腔，无菌敷料覆盖切口。对照组于松解下肺韧带后取材，不作血流阻断；缺血组于阻断肺门1 h后取材；再灌注1、3、6 h组于阻断肺门1 h后去除血管夹，恢复肺组织血供，分别于再灌注1、3、6 h后取材，取材前予生理盐水冲洗肺组织。阻断上、下腔静脉血流处死动物。穿刺左心耳，经右心室行压力灌洗(30 mL生理盐水，2.94 kPa)，完整取出左全肺后，置液氮中-80 ℃保存。

1.3 检测指标及方法

1.3.1总RNA、总蛋白提取及测定 用TRIzol及microRNA提取专用试剂盒，提取标本肺组织的总RNA，紫外线分光光度计测定吸光度(A)值。蛋白裂解液及蛋白酶抑制剂中研磨并超声裂解肺组织，离心，加SDS后水浴，-20 ℃保存。

1.3.2microRNA-451蛋白表达检测 采用RT-qPCR方法，通过microRNABase及相关文献[4]获取其引物序列。microRNA-451引物序列：5′-AAA-CCGUUACCAUUACUGAGUU-3′，应用PrimeScript®RT reagent Kit试剂盒TaqMan®探针分析法进行逆转录，逆转录产物cDNA置-20 ℃冰箱保存备用。按照Premix Ex Taq及TaqMan®MicroRNA Assay Kit试剂说明书进行PCR标准程序扩增，U6为内参(引物序列为5′-GTGCTCGCTTC-GGCAGCACATATACTAAAATTGGAACGATA-CAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAG-GATGACACGCAAATTCGTGAAGCGTTCCAT-ATTT-3′)，检测microRNA-451相对表达量。

1.3.3P-AKT蛋白表达检测 采用Western blot方法，以GAPDH作为对照,行SDS-PAGE电泳。电泳完成后转至硝酸纤维膜上，室温下封闭2 h,TBST缓冲液洗3次,加入兔抗大鼠p-AKT多克隆抗体(1∶1 500)，4 ℃孵育过夜；用TBST漂洗3次，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶4 000)，室温孵育1 h；TBST及TBS各洗3次，ECL系统曝光显影,凝胶分析系统分析p-AKT蛋白的表达。实验重复3次。

1.4 统计学处理

应用SPSS 19.0软件进行统计学处理，数据间比较采用单因素方差分析及LSD-t检验法，以P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 各组microRNA-451表达比较

对照组、缺血组、再灌注1 h组、再灌注3 h组、再灌注6 h组microRNA-451相对表达量分别为0.39±0.34、1.79±1.27、1.86±0.98、2.08±1.44、0.58±0.63。与对照组比较，缺血组、再灌注1 h组、再灌注3 h组、再灌注6 h组microRNA-451的相对表达量呈现先上调后下调的趋势，其中再灌注3 h组microRNA-451的表达量最高，差异有显著意义(F=17 244.32,P<0.05)。

2.2 各组p-AKT蛋白表达比较

对照组、缺血组、再灌注1 h组、再灌注3 h组、再灌注6 h组的p-AKT蛋白相对表达量分别为0.32±0.01、0.18±0.02、0.16±0.01、0.13±0.01、0.21±0.02。对照组AKT蛋白相对表达量最高，再灌注3 h组表达量最低，差异有显著性(F=136.02,P<0.05)。

3 讨 论

microRNA是一类内源性非编码小RNA，具有高度保守的基因序列，在RNA聚合酶Ⅱ的催化下细胞核内转录出序列较长的pri-microRNA，经过Drosha酶及Dicer酶的修饰可形成成熟的micro-RNA，它可与序列基本互补的mRNA结合，通过阻止蛋白质翻译过程或直接降解mRNA，实现基因表达的调控作用，从而影响细胞的增殖、分化、凋亡、新陈代谢等过程。NAN等[5]研究结果显示，micro-RNA-451可抑制胶质瘤细胞生长、增殖，促进细胞的凋亡。WANG等[6]研究结果显示，microR-451 可靶向调控RAB14，从而显著抑制非小细胞肺癌生长。BRANDRES等[7]研究显示，microRNA-451在胃及结直肠癌中呈低表达，且表达水平与预后呈正相关，将pre-microRNA-451转染入结直肠癌细胞中, 肿瘤细胞生长受到抑制。TIAN等[8]研究显示，人脑胶质瘤细胞中microRNA-451可通过CAB39抑制PI3K/AKT途径，从而抑制肿瘤细胞生长。

AKT蛋白是一种丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶，它处于PI3K/Akt 信号转导通路的核心部位，可通过PDK-1磷酸化Thr308、Ser473两个位点后，实现完全激活，发挥生物学活性。近年来，对于p-AKT的研究不断深入，大量研究证实，AKT蛋白具有促进细胞生长增殖，抑制细胞凋亡的作用[9]。已有研究结果显示，p-AKT蛋白在非小细胞肺癌、胰腺癌、甲状腺癌、乳癌、卵巢癌、胃癌及结直肠癌等组织中均表达增高[10]。WIDMANN等[11]研究结果显示，细胞凋亡时，AKT可出现水解现象，表达量降低。JETZT等[12]将AKT的磷酸化位点灭活，通过一种复制缺陷型腺病毒将失活的AKT转入肿瘤细胞，发现肿瘤细胞的增殖受到抑制。

本研究应用RT-qPCR以及Western blot法，检测microRNA-451及P-AKT蛋白在大鼠肺缺血再灌注组织中的表达情况，结果显示两者在表达上存在一定的相关性。结合相关文献结果[8,13]，认为microRNA-451可能通过调节p-AKT蛋白的表达对细胞的增殖和凋亡发挥作用。本文的实验结果显示，随着缺血再灌注时间的延长，microRNA-451的表达呈现先上调后下降的趋势，而p-AKT蛋白的表达则是呈现先下降后上调的相反的结果，推断microRNA-451促进细胞凋亡的作用可能是通过调节p-AKT蛋白通路实现的。这有可能为肺缺血再灌注损伤的预防及治疗提供一条新的思路。但是，microRNA-451对p-AKT蛋白调节的具体机制尚需要进一步研究。microRNA-451是否存在其他靶点对缺血再灌注损伤进行调控及p-AKT蛋白调控细胞周期的具体机制目前尚未得到证实。

[参考文献]

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