平喘固本合剂对哮喘小鼠气道急性炎症的影响

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(1 青岛大学医学院附属医院肺功能室，山东 青岛 266003； 2 青岛市妇女儿童医院)

支气管哮喘是一种常见的慢性呼吸系统疾病，可累及不同年龄组的人群，其发病率持续上升，给哮喘病人的家庭带来了沉重的经济负担[1]。目前,儿童支气管哮喘的治疗以全球哮喘病防治会议委员会(GINA)方案推荐的吸入糖皮质激素抗炎治疗为主，但长期应用的安全性存在争议[2]，探讨新的治疗方法和治疗途径有深远的意义。平喘固本合剂是在人参五味子汤及小青龙汤基础上通过辨证形成的中药制剂，主要由人参、白术、茯苓、炙甘草、五味子等组成。本文探讨平喘固本合剂对哮喘小鼠急性气道炎症的影响及相关机制，旨在为中药治疗支气管哮喘提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

健康雌性昆明小鼠40只，3～4周龄，体质量为15～19 g，由青岛市实验动物中心提供,饲养于我院SPF级实验动物中心。卵清蛋白干粉剂(OVA)，美国Sigma公司生产；氢氧化铝粉，石家庄五岳制药厂生产；平喘固本合剂，自制；空气驱动雾化器，德国百瑞公司；白细胞介素4(IL-4)、干扰素γ(IFN-γ)、酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒，美国R&D公司生产。

1.2 平喘固本合剂制备

平喘固本合剂的组成：人参8 g，白术6 g,茯苓10 g,炙甘草3 g, 五味子6 g等。制备方法：所有药物冷水浸泡0.5 h，陶器砂锅武火煮沸后，文火煎15 min，过滤，留取药汁；药渣加冷水煮沸后，再熬10 min，留取药汁，两次药汁共约100 mL混合，装入已消毒玻璃容器，4 ℃冰箱保存备用(所有中药的保存时间均不超过4 d)。

1.3 动物分组及处理方法

将小鼠随机分为正常对照组(A组)、哮喘模型组(B组)、平喘固本合剂治疗组(C组)，每组8只。根据文献[3-5]方法，B、C组分别于实验的第1、8、15天腹腔注射含OVA 100 μg和氢氧化铝粉2 mg的混悬液0.3 mL，A组于相同时间腹腔注射磷酸盐缓冲液(PBS)0.3 mL。第22天起将B、C组小鼠分别放于4 L自制玻璃雾化箱内，以50 g/L 的OVA 进行雾化吸入激发， 每日1 次, 每次30 min，连续10 d。A组雾化吸入PBS液。同时,C组每天给予平喘固本合剂0.6 mL(含生药0.4 g)胃饲。

1.4 检测指标及方法

1.4.1支气管肺泡灌洗液(BALF)中细胞计数及分类 各组小鼠于末次激发24 h内腹腔注射100 g/L水合氯醛0.5 mL/kg麻醉，放血处死后，常规消毒颈、胸皮肤，开胸(避免损伤肺脏)，结扎左肺，用5号注射针头插入小鼠主气管，再以1 mL注射针管取PBS液0.5 mL进行肺泡灌洗，反复进行3次，每次灌注后立即回吸，回收率达70%～80%。将回收的BALF存放在1.5 mL的EP管中，取0.1 mL于血细胞计数板进行细胞总数测定；剩余BALF离心(1 500 r/min，10 min，4 ℃)后，取其上清液置于-80 ℃冰箱中待测。沉渣于1 h涂片，Wright-Giemsa染色，光镜下计数200个细胞，计算各种细胞的数量及百分比。

1.4.2组织病理学观察 打开小鼠胸腔，观察肺脏的大体改变；取左侧肺脏，经40 g/L多聚甲醛液固定约24 h，脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制备厚3 μm的标准切片，苏木精-伊红(HE)染色，电子显微镜下观察。

1.4.3BALF中IL-4、IFN-γ的测定 采用ELISA法检测BALF中IL-4、IFN-γ的含量，按试剂盒说明书操作。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0软件包进行数据处理，多组数据间比较采用方差分析，两两比较采用LSD检验，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组BALF中细胞总数及细胞分类比较

与A组比较，B组BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞明显增多(F=85.70～127.69，P<0.05)，哮喘模型制作成功；C组细胞总数、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、巨噬细胞较B组均明显减少，但较A组明显升高，差异有显著意义(q=2.15～10.08，P<0.05)。见表1。

2.2 各组BALF中IL-4和IFN-γ含量比较

与A组比较，B组中IL-4含量、IL-4/IFN-γ明显升高，IFN-γ明显降低，差异有统计学意义(F=186.17～378.06,q=17.02～21.46,P<0.05)。与B组比较，C组IL-4、IL-4/IFN-γ降低，IFN-γ升高,差异有显著性(q=4.80～7.18，P<0.05)。见表2。

nA80.77±0.210.02±0.010.27±0.070.51±0.10B88.77±1.390.72±0.31 2.52±0.793.79±0.57C84.65±1.20 0.22±0.09 1.43±0.36 2.41±0.68

nIL-4(ρ/ng·L-1)IFN-γ(ρ/ng·L-1)IL-4/IFN-γA865.69±3.53653.73±24.750.09±0.01B8103.02±5.59 390.21±21.790.26±0.01 C890.27±4.82 444.73±26.320.20±0.02

2.3 各组小鼠呼吸道组织病理改变

A组细支气管纤毛排列整齐，管腔黏膜完整；血管腔、肺泡腔、肺间质均未见到明显炎症细胞(嗜酸性粒细胞)浸润。B组小鼠支气管上皮细胞增生，黏膜层增厚，局部脱落，管腔内充满大量黏液；支气管壁周围有大量炎症细胞(嗜酸性粒细胞、淋巴细胞)浸润，支气管壁痉挛明显。C组炎症反应较B组明显减轻，黏膜上皮无脱落，增生不明显，黏液分泌较少，含有少量的炎症细胞。

3 讨 论

哮喘是由包括嗜酸性粒细胞、肥大细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、气道上皮细胞和树突状细胞等在内多种细胞共同参与的气道慢性炎症性疾病。其发病机制比较复杂，至今仍未完全明了，但目前普遍认为Th1/Th2免疫失衡是哮喘发病机制中的重要环节[6-7]。Th2细胞通过分泌IL-4、IL-5、IL-9、IL-10等多种细胞因子促进嗜酸性粒细胞炎症反应及浆细胞释放免疫球蛋白(IgE)，而IgE又可以触发组胺、白三烯等多种炎症递质的释放，引起支气管痉挛、黏膜水肿、黏液分泌增加，从而导致哮喘的典型症状[8]。其中最具有代表性的是IL-4,它是驱动Th0细胞向Th2细胞转化的重要因子，一方面可以抑制嗜酸性粒细胞的凋亡，促进气道嗜酸性粒细胞的浸润，发生炎症反应，诱导黏液素基因表达和气道黏液高分泌，从而引起气道的阻塞狭窄；另一方面，它还参与哮喘气道高反应的发生与发展[9-10]。NAKAJIMA等[11]研究结果表明，敲除或者封闭IL-4能够抑制过敏性疾病和其他哮喘症状的发生。Th1细胞则主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12、TNF-β等介导细胞免疫应答和迟发性超敏反应，其中IFN-γ可通过激活IL-17F干扰素诱导蛋白信号-10通路、T盒转录因子蛋白、一氧化氮途径以及下调嗜酸性粒细胞趋化因子受体等途径抑制哮喘的炎症反应[12]。IFN-γ和IL-4是一对相互拮抗的细胞因子，其比例的失衡，是哮喘病人体内IgE合成过多的主要原因[13]，且血清IL-4/IFN-γ的升高与哮喘严重程度有关，其水平在有效治疗后下降[14]。

平喘固本合剂是在人参五味子汤及小青龙汤治疗哮喘研究基础上，通过辨证形成的方剂。前期研究结果表明，人参五味子汤及小青龙汤能通过调节Th1/Th2失衡等有效地改善气道炎症反应，缓解或抑制气道重塑，治疗效果与吸入布地奈德相似[15-16]。药理学研究表明，平喘固本合剂组方中多种中药具有平喘作用，如甘草酸是从甘草中分离出来的三萜类成分，甘草酸苷能减少哮喘大鼠外周血及肺组织中IL-4的表达，促进IFN-γ的表达，减轻中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞的产生及浸润，明显缓解大鼠哮喘发作程度[17]；麻黄为宣肺平喘的药物，其主要成分为麻黄碱、右旋麻黄碱和麻黄恶唑酮，具有兴奋支气管平滑肌细胞膜上β2受体之作用，并可升高细胞内cAMP水平，通过钙离子激活钾通道等，舒张支气管平滑肌。熊瑛等[18]研究结果显示，麻黄提取物对哮喘豚鼠气道炎症有明显的调控作用，使豚鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞明显减少；气道黏膜上皮损伤与脱落以及炎性细胞浸润明显减轻。黄芩主要成分为黄芩素，黄芩素可以抑制嗜酸性粒细胞募集相关的嗜酸细胞活化趋化因子的产生起到治疗支气管哮喘的作用。

本实验采用OVA致敏的哮喘小鼠作为研究对象，模拟哮喘发作的急性期，以BALF中IL-4和IFN-γ的浓度、细胞计数与分类为研究指标，结合其病理改变来观察平喘固本合剂对哮喘小鼠气道急性炎症的影响。结果显示，与正常对照组相比，哮喘模型组小鼠BALF中细胞数增多，IL-4和IFN-γ比例失衡，肺组织气道黏膜上皮损伤重、炎性细胞浸润增多，差异有显著性，提示造模成功。与哮喘模型组比较，平喘固本合剂治疗组小鼠BALF中细胞总数、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞明显减少；HE染色观察显示，肺组织气道黏膜上皮损伤脱落以及炎性细胞浸润情况明显减轻；反映Th1和Th2细胞平衡的IL-4和IFN-γ含量及比例亦明显改善，提示平喘固本合剂治疗哮喘有效。

综上所述，平喘固本合剂对哮喘小鼠气道炎症有明显的调控作用，其作用机制可能与抑制IL-4的表达、抑制炎性细胞聚积及促进IFN-γ的表达等有关。但其信号传导有待于进一步研究。

[参考文献]

[1]BAHADORI K, DOYLE W M, MARRAC, et al. Economic burden of asthma: a systematic review[EB/OL]. http://www.biomedcentral.com/1471-2466/9/24.

[2]王涛,李云,叶义言,等. 吸入性糖皮质激素对哮喘儿童骨龄及生长发育的影响[J]. 中国当代儿科杂志, 2012,14(5):359-361.

[3]朱艳芬,宋泽庆. 小鼠支气管哮喘模型的研究现状[J]. 国际呼吸杂志, 2009,29(7):438-442.

[4]杨召川,陈蕾,刘秀美,等. 中药二步序贯治疗对哮喘小鼠气道组织核因子κB系统的影响[J]. 中国中西医结合儿科学, 2011,3(1):23-26.

[5]王立生,张春玲. 氯吡格雷对支气管哮喘小鼠脑源性神经营养因子影响[J]. 齐鲁医学杂志, 2011,26(5):438-442.

[6]WILLS-KARP M, NATHAN A, PAGE K, et al. New insights into innate immune mechanisms underlying allergenicity[J]. Mucosal Immunology, 2010,3(2): 104-110.

[7]DEO S S, MISTRY K J, KAKADE A M, et al. Role played by Th2 type cytokines in IgE mediated allergy and asthma[J]. Lung India: Official Organ of IndianChest Society, 2010,27(2):66-71.

[8]LEMANSKE R F, BUSSE W W. Asthma: clinical expression and molecular mechanisms[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010,125(2 Suppl 2): S95-102.

[9]KIRSTEIN F G, HORSNELL D A, KUPERMAN X, et al. Expression of IL-4 receptor alpha on smooth muscle cells is not necessary for development of experimental allergic asthma[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2010, 126(2):347-354.

[10]PERKINS C, YANASE N, SMULIAN G, et al. Selective stimulation of IL-4 receptor on smooth muscle induces airway hyperresponsiveness in mice[J]. Journal of Experimental Me-dicine, 2011,208(4):853-867.

[11]NAKAJIMA H, TAKATSU K. Role of cytokines in allergic airway inflammation[J]. International Archives of Allergy and Immunology, 2007,142(4):265-273.

[12]KAWAGUCHI MIO, KOKUBU F, HUANG S K, et al. The IL-17F signaling pathway is involved in the induction of IFN-gamma-inducible protein 10 in bronchial epithelial cells[J]. Journal of Allergy and Clinical Immunology, 2007, 119(6): 1408-1414.

[13]韩征利,董翠香,曲政海,等. 小青龙汤和人参五味子汤二步序贯治疗对哮喘小鼠呼吸道炎症与重塑的影响[J]. 实用儿科临床杂志, 2011,26(4):289-292.

[14]刘伟,李洁,李玉兰,等. 胸腺素α1对支气管哮喘病人IFN-γ/IL-4 失衡及肺功能的调节作用[J]. 青岛大学医学院学报, 2007,43(6):494-496.

[15]曲政海,刘小梅,谢宁,等. 人参五味子汤预防小鼠哮喘的作用机制研究[J]. 中国中西医结合急救杂志, 2008,15(4):201-204.

[16]刘秀美,曲政海,洪爽. 中药二步序贯治疗对哮喘小鼠肺组织GATA-3表达及气道炎症的影响[J]. 中国中西医结合儿科学, 2009,1(4):304-307.

[17]吕小华,吴铁,覃冬云. 甘草对慢性小鼠哮喘模型气道炎症及外周血Th-1/Th-2失衡的影响[J]. 中国临床药理学与治疗学, 2006,11(5):532-534.

[18]熊瑛,熊彬,王宋平,等. 麻黄水提物对哮喘豚鼠气道炎症和气道上皮细胞STAT1信号传导影响[J]. 西部医学, 2008,20(5):913-916.