食用菌半纤维素酶系研究进展

王孟兰, 赵 妍, 陈明杰，2, 汪 虹

(1. 上海市农业科学院食用菌研究所 农业部南方食用菌资源利用重点实验室 上海市农业遗传育种重点开放实验室，上海 201403； 2. 南京农业大学 生命科学学院， 南京 210095)

半纤维素是仅次于淀粉和纤维素的一大类碳水化合物，如秸秆中半纤维素的含量占其干重的25%～50%[1]。10年前的能源危机引起了科学家对由半纤维素发酵生产乙醇的研究；此后，科学家们经过努力，对半纤维素的种类、结构、性质有了明确的认识，鉴定、克隆了各种半纤维素酶及其基因，研究了多种能分解利用半纤维素的微生物，并对一些微生物进行了代谢工程方面的研究。食用菌(edible fungi)是可供食用的蕈菌，而蕈菌则是指能形成大型的肉质(或胶质)子实体或菌核组织的高等真菌的总称。绝大多数食用菌是腐生性的，主要包括木腐菌和粪草菌[2]。粪草菌能以稻草、玉米、大豆等秸秆为主要生长基质，通过生物转化将其转变为具有较高附加值的食用子实体，因此具备纤维素、半纤维素酶系。草质纤维是一个复合结构，其中木质素侧枝与半纤维素结合形成一个十分致密的网络结构，将纤维素紧紧包裹在里面，所以要降解纤维素，必须先降解半纤维素和木质素[3]。因此对于食用菌中半纤维素酶基因及其功能的研究，不仅有助于了解草质纤维的降解机制，还将对研究半纤维素酶在实际生产中的有效应用具有重要意义。

1 食用菌半纤维素酶系组成

食用菌降解半纤维素主要是β-1, 4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-阿拉伯呋喃糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、α-葡萄糖醛酸酶等共同作用[4]。半纤维素酶系中的木聚糖酶主要为胞外酶，木糖苷酶属胞内酶。这样的分布与酶的催化作用有一定的相关性。β-1, 4-内切木聚糖酶(endo-1, 4-β-xylanase, EC 3.2.1.8)，简称木聚糖酶，主要作用于木聚糖主链的β-1, 4-糖苷键，产生低聚木糖或带有侧链的寡聚木糖，降低聚合度，因此木聚糖酶主要分布在胞外。β-木糖苷酶(β-xylosidase, EC 3.2.1.37)主要水解短链的低聚木糖或木二糖，并从非还原性末端释放出木糖[5]，产生菌体能直接利用的糖，因此木糖糖苷酶主要分布在胞内。而α-阿拉伯呋喃糖苷酶(α-L-arabinofuranosidase, EC 3.2.1.55)[6]、α-葡萄糖醛酸酶(α-glucosiduronase, EC 3.2.1.139)[7]、乙酰木聚糖酯酶(acetylxylan esterase, EC 3.1.1.72)等主要分解侧枝，与木聚糖酶和木糖糖苷酶协同起作用(见图1)。据相关研究报道木聚糖酶和木糖苷酶是其中的关键酶[8]，目前针对木聚糖酶的研究也最多。

图1半纤维素酶系的降解作用[8，9]

2 食用菌半纤维素酶系性质

不同食用菌种类在不同的培养条件下所分泌的半纤维素酶具有不同的酶学特性，关于食用菌半纤维素酶系的木聚糖酶、木糖苷酶等的性质都有研究报道。大部分食用菌所产的木聚糖酶都为中高温的酸性酶[10]，最适反应温度在40℃～60℃之间，最适反应pH值在4～6之间。裴建军等[11]以蔗糖、果胶、羧甲基纤维素或木聚糖为碳源培养草菇(Volvariellavolvacea)V23菌株，对其所产生的半纤维素酶进行了初步研究，发现半纤维素酶系主要受木聚糖诱导。草菇V23的木聚糖酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH值为5.8，在pH值5.4～7.0时比较稳定，保温1 h酶活的半衰温度是55℃；木糖苷酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH值为6.6，在pH值6.6～7.4时比较稳定，保温1 h酶活的半衰温度是52℃；阿拉伯糖苷酶的最适反应温度为60℃，最适反应pH值为5.0，在pH值4.6～6.2时比较稳定，保温1 h酶活的半衰温度为60℃。张瑞景等[12]以玉米芯+麸皮作为碳源，硝酸铵作为氮源栽培蟹味菇(Hypsizigusmarmoreus)，发现有木聚糖酶产生，且木聚糖酶的最适反应温度是35℃，最适反应pH值为4.6。胡沂淮等[13]通过各级浓缩和纯化，获得接近电泳纯的草菇胞外木聚糖酶并研究了其酶学性质，草菇木聚糖酶相对分子质量为24500，为糖基化修饰的蛋白，含有质量分数20.24%的糖，O-糖基化能增加木聚糖酶的活性，O-和N-糖基化均能提高木聚糖酶的稳定性，该酶的稳定pH值为6.5，57℃时半衰期为1 h。

大部分食用菌的木糖苷酶的最适反应温度在40℃～60℃，最适pH值在5.0～7.0之间。吴华伟等[14]在发酵罐中以稻草粉为基质进行培养，分离纯化了草菇中的木糖苷酶并研究了其酶学性质，测得该酶由4个亚基组成，仅对对硝基苯基-β-D-木糖苷有专一水解作用；该酶催化反应的最适温度为55℃，最适pH值为6.41～6.76，在pH值5.78～7.68之间酶活性相对稳定。

3 食用菌半纤维素酶系基因工程

目前已经对多种重要食用菌进行了全基因组测序与分析，如在分析草菇基因组时，Chen等[15]找到了285个编码碳水化合物水解酶的基因，数字基因表达谱(Digital gene expression, DGE)分析发现其中239个基因有表达，且草菇糖苷水解酶的组成与其它担子菌显著不同，草菇中富含糖苷水解酶家族GH10(降解半纤维素)、GH43(降解半纤维素和果胶)。该结论与Bao等[16]的研究一致，且Bao等在对草菇基因组进行测序与分析时发现，草菇中存在参与植物多糖降解的CAZy家族，分别有47、101、57个CAZymes与纤维素、半纤维素、果胶的降解有关，高于其它担子菌相应的值分别为36、77、37。草菇中存在大量糖苷水解酶家族GH10，推测为β-1, 4-内切木聚糖酶[17]，是其它食用菌中该基因平均含量的4倍以上，表明草菇中含有丰富的编码半纤维素酶系的基因。很多研究者还克隆了担子菌中的其它半纤维素酶系基因，包括香菇(Lentinulaedodes)(AAL04152.1)[18]、裂褶菌(Schizophyllumcommune)(AAB29056.1)[19]等多种食用菌的半纤维素酶基因的信息(见表1)。

Piet等[20]从双孢蘑菇(Agaricusbisporus)中克隆了编码木聚糖酶的基因xlnA，并在菌丝的生长过程中检测到了xlnA基因的高效表达。丁少军等[21]利用真菌CBD的高度保守性序列设计寡核苷酸引物，用RACE方法进行草菇V14木聚糖酶cDNA的克隆，并已在GenBank上登录，编号为AY316307，命名为xyn1。目前以酵母细胞作为宿主，使部分食用菌的半纤维素酶基因得到了异源表达。叶戋等[22]成功克隆了平菇(Pleurotusostreams)木聚糖酶cDNA，并在毕赤酵母GS115中进行了异源表达，测得该重组酶的最适反应温度为55℃，最适反应pH值为6.6，在pH值5.5～8.5范围内能维持50%以上的酶活性，在70℃处理5 min则完全失活，在50℃和60℃处理10 min，分别残余82.3%和41.0%的活性，并且该重组酶对山毛榉木聚糖具有很好的水解效果。对于除木聚糖酶以外的半纤维素酶，学者们也开始了分子生物学研究，且初见成效。Ding等[23]克隆了草菇V14菌株的乙酰木聚糖酯酶基因，并在GenBank上登录(编号ABI63599.1)，随后在毕赤酵母中实现了其高效表达。Chong等[24]在裂褶菌(Schizophyllumcommune)中克隆了α-葡萄糖醛酸酶基因agu1，并分析了该基因与木聚糖酶基因xynA的协同表达情况。谢春芳等[25]通过对假密环菌(Armillariellatabescens)cDNA克隆文库的随机测序及RACE技术，成功获得了阿拉伯糖苷酶的全长cDNA，并用生物信息学方法对其进行了分析，发现该全长cDNA序列与多形拟杆菌的阿拉伯糖苷酶序列具有较高的同源性，在毕赤酵母菌GS115中对所获得的基因进行了高效表达，相对酶活性达到了81.25%。

表1 已克隆报道的几种主要食用菌的半纤维素酶基因

高效产酶工程菌的构建，将对半纤维素酶的应用起到巨大推动作用。Cheng等[29]构建了毛柄金钱菌gpd启动子驱动的福寿螺多功能纤维素酶基因mfc的真核表达载体，采用PEG介导法成功地将目的基因重组到色氨酸营养缺陷型灰盖鬼伞的染色体上，分子鉴定与酶活力测定结果表明：mfc基因确实已整合到灰盖鬼伞基因组中，能够实现高效表达，其木聚糖酶活力为235 U/mL，达到对照组的2.97倍。随着食用菌转基因技术的不断发展与日趋成熟，有望实现将更多编码半纤维素降解酶的基因导入栽培食用菌中，以提高其对栽培基质的利用率或用于开发新型栽培基质，从而提高栽培食用菌的产量与质量。

4 食用菌半纤维素酶系活性

食用菌(尤其是粪草菌)的栽培原料有较大一部分来自农作物的秸秆。碳水化合物活性酶，如水解植物细胞壁多糖的纤维素酶与半纤维素酶在基质降解过程中扮演了重要的角色。Ahlawat等[30]以草菇不同菌株为试验材料，研究发现木聚糖酶活性在合成培养基中对草菇产量十分关键。李晓博等[31]测定了培养料不同发酵阶段与接种双孢蘑菇后不同生长阶段的半纤维素酶活性变化及培养料中半纤维素含量的改变，试验结果表明：在培养料发酵与双孢蘑菇生长发育期间，半纤维素酶活性的变化与半纤维素的降解速率成正相关，即酶活性高降解速率快，酶活性低降解速率慢；同时还选用了不同培养料来栽培双孢蘑菇，结果发现采用稻草的产量是最高的。Isikhuemhen等[32]使用厌氧发酵的复合培养料培养平菇菌丝，并对平菇的产量进行了研究，发现加入70%～80%秸秆、10%～20%固体废物、10%～20%粟的复合培养料袋栽的平菇产量最高，达到了874.8～958.3 g/kg；同时他们还比较了不同培养料处理的纤维素、半纤维素以及木质素减少量，发现纤维素与半纤维素的减少量与产量呈正相关，而木质素的大量减少不一定形成高的平菇产量；进一步的酶活性测定结果表明，木聚糖酶的活性在出菇后更高，其活性高低与子实体产量呈正相关。他们[33]对茶树菇(Agrocybeaegerita)的产量与半纤维素酶活性方面也做了相关研究，发现茶树菇在合成培养基中生长时会降解纤维素、半纤维素、木质素，其中木聚糖酶在出菇后活性高，而木糖苷酶在第2次出菇潮时活性升高，即半纤维素酶活性与茶树菇子实体的形成相关。

5 问题与展望

半纤维素是一类极为丰富的自然资源，广泛存在于农业废弃物中，其降解产物可作为一种较好的碳源，食用菌能够利用这些碳源产生供人们食药用的子实体，从而达到农业固废循环的高效利用。食用菌的半纤维素酶系主要是受木聚糖诱导，酶系中各组分酶的表达分泌是一个受碳源诱导和生长周期两个因素、转录和翻译两个水平上的多重调控系统[34]，其具体的诱导表达调控机制尚不十分明了。若能深入开展食用菌半纤维素酶系表达调控机理及半纤维素代谢途径的研究，将有可能从根本上促进食用菌(尤其是粪草菌)利用植物纤维素的效率。

除了在食用菌栽培中起作用，半纤维素酶系已经在更多领域里得到应用，如在谷物食品(主要是面包)上，应用木聚糖酶可以水解谷物面粉中的木聚糖产生木寡糖，从而大大改善了面包的质地、结构以及松软度；同时将半纤维素酶用于漂白硫酸盐纸浆，其优点在于能够提高纸浆的可漂性而减少氯的使用量，从而减轻了对环境的污染。随着对半纤维素酶系不断地深入研究，相信其在乙醇发酵生产、食品加工、低聚糖制备、饲料加工、纸浆溶解以及纸浆漂白等诸多方面都将具有广阔的应用前景。

参考文献：

[1]Ning L, Yang P, Wang Y, et al. Cloning, expression, and characterization of protease-resistant xylanase fromStreptomycesfradiaevar. k11[J]. Journal of Microbiology and Biotechnology, 2008, 18: 410-416.

[2]吕作舟. 食用菌栽培学[M]. 北京：高等教育出版社, 2006, 58-64.

[3]张晓勇, 高向阳, 陈秀霞, 等. 纤维素酶半纤维素酶的应用及分子相关性[J]. 纤维素科学与技术, 2006, 14(1): 47-51.

[4]Choi I D, Kim H Y, Choi Y J. Gene cloning and characterization of α-glucuronidase ofBacillusstearothermophilusno. 263[J]. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2000, 64: 2530-2537.

[5]Zhang G M, Huang J, Huang G R, et al. Molecular cloning and expression of a new xylanase gene fromPlectosphaerellacucmerina[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2007, 74: 339-346.

[6]薛业敏, 卢 晨, 毛忠贵, 等. 阿拉伯糖苷酶基因的克隆、表达及表达产物的酶稳定性[J]. 中国农业大学学报, 2003, 8(5): 9-13.

[7]Tenkanen M, Siika-aho M. An α-glucuronidase ofSchizophyllumcommuneacting on polymeric xylan[J]. Journal of Biotechnology, 2000, 78: 149-161.

[8]Polizeli M L, Rizzatti A C, Monti R, et al. Xylanases from fungi: properties and industrial applications[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2005, 67: 577-591.

[9]Lvet K, Corrado G．Heterologous expression，purification，crystallization, X-ray analysis and phasing of the acetyl xylan esterase fromBacilluspumilus[J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2005, 1748(2): 222-230.

[10]韩 伟. 食用菌产胞外纤维素半纤维素降解酶类的研究进展[J].中国食物与营养, 2012, 18(1): 36-38.

[11]裴建军, 胡沂淮, 邵蔚蓝. 草菇半纤维素酶系统的诱导、分布及初步定性[J]. 无锡轻工大学学报, 2003, 22 (1): 61-64.

[12]张瑞景, 朱启忠, 高丽伟, 等. 蟹味菇产木聚糖酶的条件及其酶性质的研究[J]. 北方园艺, 2010, 16: 189-191.

[13]胡沂淮. 草菇木聚糖酶的纯化提取和酶学性质[J]. 无锡轻工大学学报, 2004, 23(5): 86-90.

[14]吴华伟, 戴 军, 邵蔚蓝. 草菇中木糖苷酶的分离纯化及其酶学性质[J]. 无锡轻工大学学报, 2004, 23(3): 30-35.

[15]Chen B Z, Gui F, Xie B G, et al. Composition and expression of genes encoding carbohydrate-active enzymes in the straw-degrading mushroomVolvariellavolvacea[J]. Plos One, 2013, 8(3): e58780. doi:10.1371/journal. pone.0058780.

[16]Bao D, Gong M, Zheng H, et al. Sequencing and comparative analysis of the straw mushroom (Volvariellavolvacea) genome[J]. Plos One, 2013, 8(3): e58294. doi: 10.1371/journal.pone.0058294.

[17]Vanden B J, de Vries R P. Fungal enzyme sets for plant polysaccharide degradation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 91: 1477-1492.

[18]Lee C C, Wong D W S. Cloning and characterization of the Xyn11A gene fromLentinulaedodes[J]. The Protein Journal, 2005, 24(1): 21-26.

[19]Oku T, Roy C, Watsona D C. Amino acid sequence and thermostability of xylanase A fromSchizophyllumcommune[J]. FEBS Letters, 1993, 334(3): 296-300.

[20]Piet W J, Basten J W, Sonenberg A S, et al. An endo-1, 4-xylanase-encoding gene formAgaricusbisporusis regulated by compost-specific factors[J]. Journal of Molecular Biology, 1998, 277: 273-284.

[21]丁少军, Buswell J A. 利用真菌纤维素结合域(CBD)保守性序列进行草菇木聚糖酶cDNA的克隆[J].中国生物化学与分子生物学报, 2004, 20(3): 408-412.

[22]叶 戋. 平菇木聚糖酶基因的克隆、表达及酶学性质研究[D]. 武汉：湖北大学, 2008.

[23]Ding S J. Molecular cloning, and characterization of a modular acetyl xylan esterase from the edible straw mushroomVolvariellavolvacea[J]. FEMS Microbiology Letters, 2007, 274: 304-310.

[24]Chong S L, Battaglia E, Coutinho M. The α-glucuronidaseagu1 fromSchizophyllumcommuneisa member of a novel glycoside hydrolase family (GH115)[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2011, 90: 1323-1332.

[25]谢春芳, 黄 辉, 姚冬生, 等.Armillariellatabescens阿拉伯糖苷酶基因全长cDNA的克隆与表达[J]. 暨南大学学报：自然科学版, 2006, 26(3): 476-482.

[26]Jason E S, Wilke S K, Dag A, et al. Insights into evolution of multicellular fungi from the assembled chromosomes of the mushroomCoprinopsiscinerea(Coprinuscinereus)[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107(26): 11889-11894.

[27]Decelle B, Tsang A, Storms R K, et al. Cloning, functional expression and characterization of threePhanerochaetechrysosporiumendo-1, 4-beta-xylanases [J]. Current Genetics, 2004, 46(3): 166-175.

[28]Halgasová N, Kutejová E, Timko J, et al. Purification and some characteristics of the acetylxylan esterase fromSchizophyllumcommune[J]. The Biochemical Journal, 1994, 298 (3): 751-755.

[29]Cheng S J, Yang P Z, Guo L Q, et al. Expression of multi-functional cellulase genemfcinCoprinuscinereusunder control of different basidiomycete promoters[J]. Bioresource Technology, 2009, 100(19): 4475-4480.

[30]Ahlawat O P, Gupta P, Dhar B L. Profile of the extracellular lignocellulolytic enzymes activities as a tool to select the promising strains ofVolvariellavolvacea(Bull. ex Fr.) sing.[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology, 2008, 48: 389-396.

[31]李晓博, 李 晓, 李 玉. 双孢蘑菇生产中木质素、纤维素和半纤维素的降解及利用研究[J]. 食用菌, 2009(2): 6-10.

[32]Isikhuemhen O S, Mikiashvilli N A. Lignocellulolytic enzyme activity, substrate utilization, and mushroom yield byPleurotusostreatuscultivated on substrate containing anaerobic digester solids[J]. Indian Journal of Medical Research, 2009, 36: 1353-1362.

[33]Isikhuemhen O S, Mikiashvili N A, Kelkar V. Application of solid waste from anaerobic digestion of poultry litter inAgrocybeaegeritacultivation: mushroom production, lignocellulolytic enzymes activity and substrate utilization [J]. Biodegradation, 2009, 20: 351-361.

[34]Rauscher R, Wurleitner E, Wacenovsky C, et al. Transcriptional regulation of xyn1, encoding xylanase I, inHypocreajecorina[J]. Eukaryotic Cell, 2006, 5(3): 447-456.