紫外诱变对微绿球藻生长和营养成分的影响

叶 丽， 蒋霞敏， 孙志鹏， 高秀芝， 张泽凌

(宁波大学 海洋学院， 浙江 宁波 315211)

微绿球藻(Nannochloropsisoculata)是一种海洋单细胞微藻，具有易培养、营养丰富的特点，在水产养殖中应用较为广泛，是近两年在泥蚶、蟹、虾等育苗及轮虫培养中应用较佳的经济饵料[1-4]。微绿球藻作为二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)等高度不饱和脂肪酸的新来源日益受到国内外科研工作者的重视。

目前由于微绿球藻生长速率低，采收困难和藻种退化等问题已严重阻碍微绿球藻产业的发展[5]。因此高产优质微绿球藻藻株的筛选成为当前的一个重大课题。采用He_Ne激光、γ射线以及甲基磺酸乙酯(EMS)在微绿球藻育种中的应用已见报道[6-9]，而紫外辐射在微绿球藻育种中的应用研究尚未见报道。本文针对紫外辐射微绿球藻的诱变效应进行研究，以期利用紫外辐射诱变筛选出生长快、高产EPA的优良藻株，为海洋微藻的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 藻种培养

试验用微绿球藻由宁波大学藻种室提供。采用MAV[10]培养液，智能光照箱培养，培养条件：光照强度 70 μmol·m-2·s-1，温度 25℃，光暗周期 12 h∶12 h, 培养容器1000 mL三角烧瓶，培养水体1000 mL，每天定时摇动2次。

1.2 紫外诱变与筛选

取对数生长期的微绿球藻藻液 10 mL 置于直径9 cm的培养皿中，使藻液均匀平铺在培养皿底部，藻液厚1cm，用30 W 紫外灯，照射距离为50 cm。设置不同辐照时间(0、5、10、15、20、25和30 min)，各设3 平行。辐照后立即将藻液接入 100 mL新鲜培养基，暗培养24 h，后转入智能光照箱内培养，培养条件同1.1。经数代培养后，各组重新接种到100 mL新鲜培养基中培养，接种密度10×104cell/mL。7 d 后进行生长速率检测。

1.3 突变株与出发株的比较试验

选取生长速率较快的2株突变株(MN-1和MN-2)和出发株进行扩大培养，培养容器5 L三角烧瓶，培养水体5 L，初始接种密度100×104cell/mL，采用室内培养架上培养。培养条件：日光灯光源，光照强度 60 μmol·m-2·s-1，水温 25℃，光暗周期 12 h∶12 h，其他条件同1.1。

1.4 藻体收集与保存

培养至对数末期，4500 r/min离心(Thermo)5～10 min，蒸馏水洗涤2～3次，离心、收集藻泥，经冷冻干燥，低温(-20℃)保存待用。

1.5 营养成分测定

生物量的测定采用冷冻干燥称重法；粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法(GB/T5009.5-2010)；多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法，总脂含量的测定采用氯仿-甲醇法[12， 13]。脂肪酸的测定：在抽提的总脂中加入5%～6%KOH甲醇溶液(V/V 4∶1)，充N2 1 min，60℃水浴皂化甲酯化[11]，然后用日本SHIMADZU公司QP2010气相色谱-质谱分析仪进行分析，参考脂肪酸标准和文献[12-14]，用面积归一法计算出各脂肪酸的百分含量(以占脂肪酸含量的百分比表示)。

1.6 数据统计与分析

生长速率K=(lnNt-lnN0)/t，其中Nt表示培养t时间后的细胞数，N0表示初始细胞数目，t表示试验时间。数据用Excel 2003进行常规数据处理后，用SPSS18.0软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，当差异显著时进行Turkey’s多重比较法进行组间差异显著性检验。实验数据均采用平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 不同紫外辐照时间对藻生长速率的影响

在起始密度相同的情况下，7 d后，各处理组藻株的生长速率如图1所示。与出发株相比，辐照15 min的突变株(MN-1)和辐照 20 min的突变株(MN-2)，生长速度明显加快，分别提高了21.08%和6.25%。其余辐射的突变藻株，藻体颜色变浅，生长速率显著降低(P>0.05)。因此，选择突变株MN-1和MN-2作实验用藻株。

图1 不同紫外辐射时间对微藻生长速率的影响

2.2 生物量比较

微绿球藻突变株与出发株在生物量的积累上发生了改变(图2)。与出发株(142.3 mg/L)相比，突变株MN-1的生物量增加了15.55%(163.0 mg/L)，差异显著 (P<0.05)；突变株MN-2的生物量增加了5.62%(150.3 mg/L)，但差异不显著(P>0.05)。

2.3 粗蛋白、多糖、总脂含量比较

微绿球藻突变株与出发株其粗蛋白的含量不同(图3)。与出发株的粗蛋白含量(33.01%)相比，突变株MN-1 (32.86%)和突变株MN-2 (27.56%)稍微有所下降，但三者之间均无显著差异(P>0.05)。

图 2 突变株与出发株生物量的比较

微藻的总脂含量也有所改变(图3)。出发株的总脂含量仅有23.45%，MN-1和MN-2的总脂含量分别增加了9.81%和7.93%，均显著高于出发株(P<0.05)， MN-1和MN-2的总脂无显著差异(P>0.05)。

紫外辐射处理后突变株的多糖含量也有变化(图3)。出发株的多糖含量为1.75%，而突变株MN-1的多糖含量有所下降，为1.62%，与出发株无显著差异(P>0.05)，突变株MN-2的多糖含量增加了13.72%，达到了1.99%，与出发株及MN-1均存在显著差异(P<0.05)。

图 3 突变株和出发株粗蛋白、多糖、总脂含量的比较(干重基础)

2.4 脂肪酸组成比较

如表1所示，共检测出9种脂肪酸，包括3种饱和脂肪酸(SFA) 、3种单不饱和脂肪酸(MUFA)和3种多不饱和脂肪酸(PUFA)。3个藻株的脂肪酸组成没有变化，但脂肪酸各组分含量发生了改变。SFA以MN-2的含量较高(39.16%)，显著高于MN-1(31.2%)和出发株(30.38%)；MUFA以出发株(34.4%)与MN-1(34.7%)较高，显著高于MN-2(30.52%)；n9-MUFA以出发株(11.29%)较高，显著高于MN-1(9.56%)和MN-2(9.41%)；PUFA 以MN-1(34.41%)与出发株(35.23%)较高，二者无差异，而出发株(35.23%)显著高于MN-2(30.32%)，差异显著； C20:5(n3)以 MN-1最高(28.10%)，比出发株(27.59%)增加了1.81%，差异显著(P<0. 05)，MN-2(22.16%)明显低于出发株(P<0. 05)，减少了19.71%；对于n-6PUFA，MN-2含量最高(8.16%)，出发株次之(7.64%)，MN-1最低(6.31%)。

表 1 突变株与出发株脂肪酸组成的比较(%)

3 讨论

3.1 紫外诱变对微绿球藻生长速率的影响

本实验通过不同的紫外诱变时间，获得了6个微绿球藻突变株。其中紫外辐射15 min的突变株(MN-1)和紫外辐射20 min的突变株(MN-2)的生长速率均有不同程度的增加，紫外辐射15 min的突变株MN-1尤为显著，此时微藻的生长速率达到了0.39，相对微绿球藻出发株增加了21.08%；其余时间的紫外辐射突变株的生长速率均有所下降。这是由于紫外辐射对微藻基因的改变是非定向的，不同的紫外辐射引起的突变也各不相同，因此不同微藻突变株的生长速率也不一样。

3.2 生物量、粗蛋白、多糖及总脂的比较

突变株与出发株在生物量、粗蛋白和总脂含量上均有不同程度的改变。本实验通过紫外诱变技术，得到2株突变藻株，其生物量最高为160.3 mg/L，显著高于出发株的142.3 mg/L。 但低于Ma等[15]和Kandiah等[8]的报道，这种差异与出发藻株有关。3株微藻的粗蛋白含量为32.56%～33.01%，与黄旭雄等[4]测得的蛋白含量稍有些出入。这可能与微藻的培养条件、样品处理及检测条件的不同有关。而微藻多糖的研究鲜有报道。微藻的总脂含量受诸多因素的影响，Fábregas等[16]指出微绿球藻总脂与光照有关，Chiu等[17]报道的微绿球藻总脂含量为22.7%～29.7%，具体与CO2的充入量有关。魏东等[18]报道微绿球藻的总脂含量占干重的20%～54.5%，具体与氮源、N/P和生长期有关。本试验测得的微绿球藻总脂肪含量为23.45%～25.75%，与上述报道基本一致。但与Yin等[19]报道微绿球藻总脂15.50%、蒋霞敏等[10]报道微绿球藻总脂6.52%有较大的差异。

紫外辐射引起微绿球藻生物量、粗蛋白、多糖、总脂及脂肪酸含量的变化，可能是因为为微绿球藻吸收紫外光后，微藻的DNA分子形成嘧啶二聚体，二聚体的出现会减弱双键间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，使分子结构发生变化，诱导微藻体内代谢过程的变化，从而产生上述参数的变化。

3.3 脂肪酸的比较

在3株微藻中均只检测到9种脂肪酸，与Yin等[19]报道的微绿球藻中检测到31种脂肪酸有较大出入，这可能与微绿球藻的培养条件、样品处理及检测条件的不同有关。3株微藻均含有丰富的16:0、16:1(n7)、20:5(n3)，其含量均高于19.08%，这与Jane等[7]的研究结果相一致。但与Ma等[15]、Thi等[9]报道的含量最高的脂肪酸为16:0、16:1(n7)有出入。突变株MN-2在MAV培养基中培养7 d的饱和脂肪酸(SFA)含量为39.16%，显著高于出发株和突变株MN-1，而 Thi等[9]报道的微绿球藻EMS突变株在 f/2培养基中培养18 d 时SFA的含量可达45.9%，Ma[15]等报道的微绿球藻重离子束诱变株在BG-11培养基中培养5 d时SFA的含量可达58.1%。3株微藻的MUFA含量为30.52%～34.7%，这与Ma[15]等报道的微绿球藻及其突变株的MUFA含量为29.7%～38.5%接近，但与Thi[9]等报道的微绿球藻及其随机突变株的MUFA含量34.8%～45.8%有差异。3株微藻的PUFA含量为30.32%～35.23%， 其中2个突变株的总脂含量虽有不同程度的增加，但PUFA的含量均有所降低。这与李秀波等[20]报道的微藻PUFA含量随着其油脂含量的增加而下降相符合。在Ma[15]等的报道中也出现了同样的趋势。3株微藻的EPA含量为22.16%～28.10%，远高于Ma[15]等报道的微绿球藻及其突变株EPA含量(6.1%～11.8%)，但Yin[19]等报道的微绿球藻的EPA含量高达38.39 %，原因可能是培养条件、检测方法及藻种的不同所导致的。

4结论

本次研究从6株突变株中筛选出了2株生长率高于出发株的藻株MN-1和MN-2，并在指数生长末期对其与出发株就生物量、粗蛋白、多糖、总脂及脂肪酸进行了比较发现：MN-1的生长速率增加21.08%，生物量增加14.55%，粗蛋白含量增加2.54%，总脂含量增加9.81%， EPA增加1.81%，SFA增加2.70%； MN-2的生长率增加6.25%，生物量增加5.62%，多糖增加13.26%，总脂增加7.93%， SFA增加28.9%。结合微藻生长特性，并从生物量、粗蛋白含量、多糖含量、总脂含量及脂肪酸组成等营养学角度综合考虑，通过紫外诱变改良微绿球藻具有良好的开发应用前景。

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