三种植物乙醇粗提物对松梢螟幼虫的生物活性研究

周洁尘 闫瑞坤 王圣洁 何苑皞 谭益明 周国英

（中南林业科技大学 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，长沙 410004）

三种植物乙醇粗提物对松梢螟幼虫的生物活性研究

周洁尘 闫瑞坤 王圣洁 何苑皞 谭益明 周国英

（中南林业科技大学 经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室，长沙 410004）

在室内测定了垂序商陆全草、柚果皮、博落回全草乙醇粗提物对松梢螟幼虫的生物活性，并测定了其林间防效。结果显示，不同浓度3种植物乙醇粗提物对松梢螟幼虫都有一定的生物活性，且浓度越高作用效果越强。柚皮粗提物对松梢螟幼虫的生物活性最强，100 mg/mL的柚皮粗提物对松梢螟幼虫的最高毒杀校正死亡率、拒食率、生长抑制率分别为80.00%、99.28%和96.32%，同时其林间防治效果为55.70%，与对照药剂噻虫啉的防治效果在同一显著水平。垂序商陆粗提物对松梢螟幼虫的生物活性最弱，但其高浓度粗提物校正死亡率仍在70%以上，拒食率以及生长抑制率也在90%以上。

乙醇粗提物 松梢螟 毒杀作用 拒食作用 生长抑制作用

马尾松（Pinus massoniana）是中国南方地区重要的绿化乡土造林树种和用材树种，经济价值极高且用途广泛。马尾松树干富含丰富的油脂，是生产松脂的主要树种［1］；其木材的耐腐性较好，可以应用于多个轻、重工业领域，如建筑、涂料、家具、油漆、造纸、橡胶等［2，3］；枝干可用于人工培养茯苓、松蕈等真菌；花粉可入药［4］。近几年来，马尾松人工造林面积广，且为追求高额利润而普遍连栽，导致马尾松林物种多样性丧失，虫害种类繁多且易发生大面积爆发［5］。

松梢螟（Dioryctria splendidella），又名钻心虫，可危害马尾松顶梢及松球，导致主干弯曲，严重影

响松树生长和松材材质以及果实产量。近年来，湖南衡山松林松梢螟为害情况严重，且没有较有效的防治方法。目前防治松梢螟的方法主要是抚育措施结合化学药剂防治［6］，使用化学药剂存在残留量高，对环境污染严重等各种弊端。植物杀虫资源丰富，对环境、植物本身以及害虫天敌均无影响，也不易使有害生物产生抗药性［7，8］，所以植物源杀虫剂成为时下农药研究开发的热点。刘海伟［9］研究了菊芋叶片提取物对棉铃虫的生物活性，结果表明菊芋叶片乙酸乙酯提取物对棉铃虫的生物活性作用最明显；李云寿等［10］发现紫茎泽兰对4种储粮害虫有一定的生物活性；何静［11］的研究表明了苍耳提取物对粘虫有一定的毒杀作用。博落回、垂序商陆全株有毒，近年来相关杀虫作用研究逐渐增多［12-14］，周顺玉等［15］研究了博落回对茶毛虫及茶尺蠖的生物作用，何雅蔷等［16］测定了垂序商陆对赤拟谷盗和玉米象的作用。柚果皮中含有多种活性成分，具有杀虫抑菌作用［17］。本实验室研究发现这3种植物对油茶炭疽病病原菌均具有一定的抑制作用。

国内对于防治松梢螟的植物源药剂的开发也有初步地研究，有研究表明苦参根中含有对松梢螟幼虫具有显著毒杀活性的物质［18］。本研究探索3种植物垂序商陆（Phytolacca americana L.）全草、柚（Citrus maxima）果皮、博落回（Macleaya cordata）全草的乙醇粗提物对松梢螟的3、4、5龄幼虫的生物活性作用，以期为基于植物源药剂的松梢螟防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物 垂序商陆全草采集于2012年5-8月，地点为湖南省衡阳市衡山县紫金山林场龙凤工区旁；柚皮收集于2012年9-12月，为沙田柚废弃果皮；博落回全草采集于2012年5-8月，地点为湖南省黄丰桥林场。

1.1.2 供试幼虫 松梢螟幼虫收集于湖南省衡山市紫金山林场龙泉马尾松幼林。用广口瓶作为饲养器，瓶中放入经60℃烘箱2 h消毒的松梢段，瓶口用纱布封好，培养温度为27℃左右，相对湿度为60%-80%。将松梢螟幼虫分批接入饲养器中饲养繁殖，取3、4、5龄幼虫进行试验。

1.2 方法

1.2.1 植物的预处理及粗提物的制备 将3种植物洗净置于阴凉处晾干，然后放在恒温干燥箱中以60℃的温度烘干至叶片发脆。小心取出植物用粉碎机粉碎，过40目筛。将获得干粉称重后置于密封瓶内保存备用。

采用超声波提取法［19］进行粗提物的制备，提取溶剂为乙醇。分别称取适量3种植物干粉，加入10倍体积（V/W）的90%乙醇浸渍1 d，然后置于超声波细胞粉碎机3℃温度粉碎振荡1 h，工作时间为2 s，间隙时间为0.5 s，重复超声。真空抽滤提取液，弃废渣，减压浓缩滤液至恒定重量获得浸膏状植物乙醇粗提物。用60%乙醇溶液溶解3种植物粗提物，适量添加0.1%的吐温-80，分别制成浓度为6.25、12.5、25、50和100 mg/mL的供试溶液。将试验分3组进行，分别为P.a垂序商陆粗提物各浓度供试液，C.m柚皮粗提物各浓度供试液，M.c博落回粗提物各浓度供试液。

1.2.2 毒杀作用的测定 采用浸渍法［20］。挑选健康、生长状态体重基本一致的3龄、5龄幼虫，分别放入不同浓度的植物粗提物中浸渍5 s后取出，设置清水对照及30 mg/mL市售噻虫啉阳性对照，每个浓度处理10头幼虫，3次重复。处理后的幼虫用无药新鲜松梢段正常饲养，连续观察48 h后记录试虫死亡头数，观察虫体中毒症状及死亡形态，计算校正死亡率。

死亡率（%）=死亡虫数/总虫数×100%

校正死亡率（%）=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）×100%

1.2.3 拒食作用的测定 将新鲜直径大小基本一致的马尾松梢枝条截成20 mm长的小段，分别放入不同浓度3种植物乙醇粗提物和清水中浸泡10 s。待松梢段静置阴干后用于饲喂松梢螟4龄幼虫，幼虫健康且生长状况基本一致并经过6 h饥饿处理。3种植物粗提物的不同浓度皆处理10头幼虫，并重复3次。连续观察2 d，分别在24 h与48 h时测量试虫食物摄入量，并计算拒食率［21，22］。

1.2.4 生长抑制作用测定 采用饲喂称重法［23］。将

直径大小基本一致的新鲜马尾松梢枝条截成20 mm长的小段，分别在不同浓度3种植物乙醇粗提物和清水中浸泡10 s。待松梢段静置阴干后用于饲喂松梢螟4龄幼虫，幼虫健康且生长状况基本一致并经过6 h饥饿处理。3种植物粗提物的不同浓度皆处理10头幼虫，并重复3次。用处理松梢段饲喂试虫48 h后清理饲养器，改换无处理新鲜松梢段饲喂，1 d更换一次，直到试虫化蛹。于24、48和96 h时称量试虫体重。根据试虫体重变化情况计算生长抑制率［24］。

1.2.5 林间防治效果测定 试验地点为紫金山林场龙泉村五年生马尾松幼林样地。试验方法为以3 d为一个周期施药，共施药12 d，每种植物粗提物施药15颗马尾松幼苗，并设置3个重复。同时以清水和标准农药30 mg/mL噻虫啉作为对照组。喷洒药液前调查虫口基数，分别于施药后第3天、第7天以及第15天调查幼苗整株上剩余活虫数，计算马尾松受害株率和松梢螟幼虫防治效果［25，26］。

1.2.6 数据分析 用SPSS 18.0和DPS（Data Processing System）数据处理软件进行数据分析。采用Duncan’s法分析数据差异显著性。将拒食率、生长抑制率和校正死亡率均转化为机率值，将浓度进行对数转换后绘制毒力回归方程，并计算AFC50、LC50。

2 结果

2.1 3种植物乙醇粗提物对松梢螟幼虫的毒杀作用

不同浓度植物粗提物对松梢螟5龄幼虫的毒杀结果（表1）表明，植物粗提物的浓度越高，其毒杀作用越强。其中柚皮乙醇粗提物对松梢螟5龄幼虫的毒杀作用较强，在最高浓度100 mg/mL时，其毒杀作用与30 mg/mL噻虫啉的毒杀作用差异不显著。而在浓度达50 mg/mL时，3种植物乙醇粗提物对试虫的毒杀作用均达到了60%以上，说明这3种植物对松梢螟5龄幼虫都具有一定的毒杀活性。

表1 三种植物乙醇粗提物对松梢螟5龄幼虫的毒杀作用结果

3种植物乙醇粗提物对松梢螟3龄幼虫的毒杀作用结果（表2）显示，柚皮粗提物对松梢螟3龄幼虫的毒杀作用最为明显，也与30 mg/mL噻虫啉的毒杀作用处在同一显著水平。在最高浓度100 mg/mL时，3种植物粗提物的毒杀作用均达到90%以上；仅在浓度为6.25 mg/mL时，3种植物粗提物处理后的3龄幼虫校正死亡率达50%以上；3种植物乙醇粗提物对松梢螟3龄幼虫也具有一定的毒杀活性。

表2 三种植物乙醇粗提物对松梢螟3龄幼虫的毒杀作用结果

表3显示，柚皮粗提物对5龄、3龄幼虫的毒杀中浓度LC50均小于博落回粗提物与垂序商陆粗提物，这说明柚皮粗提物具有更强的毒杀作用，与表1和表2的结果相符合。而表1-表3显示，3种植物乙醇粗提物对松梢螟3龄、5龄幼虫均具有一定的毒杀作用，而3龄幼虫的死亡率高于5龄幼虫，说明3种植物粗提物对3龄幼虫的毒杀作用皆优于5龄幼虫；每种植物粗提物对试虫毒杀作用的95%置信限皆不重叠，也说明3种植物粗提物对松梢螟3龄幼虫的毒杀与对5龄幼虫的毒杀作用差异显著。

表3 三种植物乙醇粗提物对松梢螟5龄、3龄幼虫的毒杀毒力分析

2.2 3种植物乙醇粗提物对松梢螟幼虫的拒食作用

表4中结果表明，3种植物粗提物对松梢螟4龄幼虫都有一定的拒食活性，且拒食活性随粗提物浓度的升高而增强。其中，浓度为100 mg/mL的柚皮粗提物对松梢螟幼虫的拒食作用在24 h时达到99.28%，试验中幼虫在前24 h基本不取食柚皮粗提物处理的松梢段。而在48 h后，3种植物粗提物100 mg/mL浓度对松梢螟幼虫的拒食作用在90%以上且处于同一显著水平，3种植物粗提物均表现出较强的拒食活性，这说明粗提物中拒食作用有效成分在48 h后仍有较强的作用。

表4 三种植物乙醇粗提物对松梢螟4龄幼虫的拒食作用结果

表5 三种植物乙醇粗提物对松梢螟4龄幼虫的拒食作用毒力分析

通过拒食作用毒力（表5）分析可知，柚皮乙醇粗提物的拒食中浓度相较而言最低，拒食作用效果最好，且48 h和24 h的95%置信限重复较大，说明48 h与24 h的拒食作用效果差异不显著。垂序商陆乙醇粗提物与博落回乙醇粗提物的95%置信限

同样也表现出这点。

表6 三种植物乙醇粗提物对松梢螟4龄幼虫的生长抑制作用结果

2.3 3种植物乙醇粗提物对松梢螟幼虫的生长抑制作用

表6显示，不同浓度3种植物乙醇粗提物均能在一定程度上抑制松梢螟4龄幼虫的生长，生长抑制作用随浓度的增加而增强。其中浓度100 mg/mL柚皮粗提物抑制作用最为明显，生长抑制率在处理24 h后达96.32%；而浓度100 mg/mL垂序商陆粗提物与博落回粗提物对松梢螟幼虫的生长抑制率略低于柚皮提取物，但与之相比仍处于同一显著水平。

表7 三种植物乙醇粗提物对松梢螟4龄幼虫的生长抑制作用毒力分析

经毒力分析发现，3种植物乙醇粗提物对松梢螟4龄幼虫的生长抑制作用效果没有随时间推移而减弱。从表6和表7中可以看出，3种植物粗提物在24 h后对松梢螟幼虫的生长抑制作用较96 h后强，但96 h后生长抑制率仍有90%以上，说明3种植物粗提物中的有效成分代谢半衰期较长，可以长时间保持作用效果，而其95%置信限的重叠现象也说明了这点。

2.4 3种植物乙醇粗提物林间防治效果测定

从表8可知，浓度为100 mg/mL的3种植物乙醇粗提物对松梢螟幼虫的防治均有一定效果，其中柚皮乙醇粗提物对松梢螟幼虫的林间防治效果最好，与标准农药噻虫啉作用效果相当。

3 讨论

目前，由于环境的不断恶化，化学药剂对环境的影响严重，人们越来越多地致力于从天然产物中

提取活性物质来进行病害或虫害的防治［27，28］。植物的抑菌杀虫作用是长期与昆虫和病原菌进化产生的结果，主要依赖于植物的次生代谢产物［29］。本试验中3种植物对松梢螟幼虫的毒杀作用较好且作用效果持续时间较长，这说明3种植物中杀虫活性成分可以被乙醇提取出来，且活性成分代谢半衰期较长。本试验毒杀作用的测定采用的浸虫法，虫体浸入药液后，药液可能通过口器进入消化道、也可能通过气门等进入虫体，因此毒杀作用是触杀、胃毒、熏蒸等多种作用的综合结果。而本试验仅测试了拒食作用及生长发育作用，并不能说明有效成分的具体作用方式。

表8 三种植物乙醇粗提物对松梢螟虫害的林间防治效果

植物的不同部位含有的有效成分不同，且不同的有效成分提取方法与提取溶剂不尽相同［30-32］，本试验只研究了3种植物的乙醇提取物，且均为粗提物，其有效成分复杂，为了解对松梢螟幼虫起到生物作用的主要成分、附效成分及相互间的作用效果，有必要对高活性物质分离纯化，分析其活性及化学成分。在毒杀作用测定过程中，3龄幼虫的死亡率明显高于5龄幼虫，这可能是由于幼虫处在不同的发育阶段，其代谢速率、抗药性等不同所导致的，具体杀虫机理也值得深入研究。

3种植物对松梢螟幼虫均具有较强生物活性，有潜力发展成植物源药剂，然而博落回、垂序商陆全株有毒，如果开发成植物源药剂还必须评估其对人畜以及天敌等是否安全。

4 结论

本试验从垂序商陆全草、柚果皮以及博落回中提取有效物质来进行松梢螟幼虫的防治，结果表明，这3种植物乙醇粗提物对松梢螟幼虫均有一定的生物活性，柚皮对松梢螟幼虫的毒杀作用、拒食作用以及生长抑制作用最强，且具有一定的林间防治效果。如开发成植物源农药，对于林业害虫的无公害防治具有一定的现实意义。

［1］安宁, 丁贵杰, 谌红辉.林分密度及施肥对马尾松林产脂量的影响［J］.中南林业科技大学学报, 2010, 30（9）：46-50.

［2］郑仁华, 施季森, 杨宗武, 等.马尾松纸浆材优良家系的选择［J］.南京林业大学学报：自然科学版, 2002, 26（5）：1-6.

［3］蔡树威, 龙伟, 杨章旗.马尾松不同种源采脂量与树体因子关系的研究［J］. 广西林业科学, 2006, 35（S1）：18-19.

［4］鲍甫成, 江泽慧.中国主要人工林树种木材性质［M］.北京：中国林业出版社, 1998：36-48.

［5］陈美高.闽西北马尾松人工林恢复过程中林分结构研究［D］.福州：福建农林大学, 2006.

［6］罗志荣.防治松梢螟技术要点［J］.云南林业, 2009, 30（4）：48.

［7］李建飞.植物源杀虫剂概述［J］.安徽农学通报, 2009, 15（1）：160-161, 182.

［8］罗水忠, 潘利华.柠檬苦素类似物的研究与应用进展［J］.饮料工业, 2008, 11（1）：4-7.

［9］刘海伟.菊芋叶片提取物杀虫抑菌活性的研究［D］.南京：南京农业大学, 2007.

［10］李云寿, 邹华英, 汪禄祥, 等.紫茎泽兰提取物对四种储粮害虫的杀虫活性［J］.昆虫知识, 2001, 38（3）：214-216.

［11］何静.苍耳提取物对有害生物抑制机理的研究［D］. 兰州：甘肃农业大学, 2005.

［12］郁建平, 赵东亮, 孟祥斌, 等.博落回生物碱对8种真菌的抑菌作用［J］.山地农业生物学报, 2006, 25（1）：89-91.

［13］袁淘忠, 张华生.博落回杀灭蛆蝇效果的观察［J］.中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 1999, 17（2）：128.

［14］巩忠福.博落回杀螨活性成分的研究［D］.杨凌：西北农林科技大学, 2002.

［15］周顺玉, 尹健, 陈利军, 等.博落回浸提物对茶毛虫、茶尺蠖的生物活性［J］.安徽农业科学, 2007, 35（5）：1408-1415.

［16］何雅蔷, 鲁玉杰, 仲建锋, 等.美洲商陆粗提物对赤拟谷盗和玉米象的作用研究［J］.河南工业大学学报：自然科学版, 2007, 28（2）：19-22.

［17］梁广勤, 梁帆, 吴佳教.沙田柚低温杀虫处理试验研究［J］.江西农业大学学报：自然科学版, 2002, 24（2）：223-226.

［18］赵玉敏, 顾地周, 车喜全, 等.苦参不同提取液对松梢螟幼虫的毒杀活性研究［J］.辽宁林业科技, 2008（6）：1-3.

［19］蒋春先, 熊忠梅, 李庆, 等.用吴茱萸乙醇提取物对斜纹夜蛾的生物活性进行研究［J］. 西南大学学报：自然科学版, 2008, 30（2）：105-108.

［20］黄彰欣.植物化学保护实验指导［M］. 北京：中国农业出版社, 1990.

［21］慕立义.植物化学保护研究方法［M］.中国农业出版社, 1991.

［22］陈旭, 王迎儿, 王燕燕, 等.白前提取物对斜纹夜蛾拒食活性的研究［J］.中国生物防治, 2009, 25（增1）：36-39.

［23］王海建, 钟策宏, 蒋春先, 等.巴豆提取物对小菜蛾生物活性研究［J］. 西南农业学报, 2013, 26（3）：1009-1013.

［24］崔正芳.白花曼陀罗提取物杀虫活性研究［D］.武汉：华中农业大学, 2009.

［25］贾福丽, 陈义娟, 陈佳, 等. 8种植物提取物对朱砂叶螨生物活性筛选及其研究［J］.中国农学通报, 2011, 27（24）：286-291.

［26］李涛.植物源增效复配杀螨剂研制［D］.杨凌：西北农林科技大学, 2010.

［27］徐雪莲, 刘寿柏, 卢芙萍, 等. 31种热带植物乙醇提取物对朱砂叶螨的生物活性研究［J］.热带作物学报, 2011, 32（10）：1951-1956.

［28］王法红, 曹阳, 骆焱平. 21种海南植物粗提物生物活性初步测定［J］.湖北农业科学, 2013, 52（8）：1829-1832.

［29］阎凤鸣.化学生态学［M］.北京：科学出版社, 2003.

［30］向玉勇, 何斌, 王精山. 6种植物乙醇提取物对金银花尺蠖的生物活性［J］. 东北林业大学学报, 2012, 40（11）：139-142.

［31］吴敏. 5种杉科植物不同部位的精气成分［J］.中南林学院学报, 2006, 26（3）：82-86.

［32］孙梅梅, 陈树仁, 缪勇, 等.三种植物提取物对菜青虫拒食活性的研究［J］.天然产物研究与开发, 2007, 19（4）：623-625.

（责任编辑 马鑫）

Bioactivities of the Alcohol Extracts from Three Plants Against Dioryctria splendidella Larvaes

Zhou Jiechen Yan Ruikun Wang Shengjie He Yuanhao Tan Yiming Zhou Guoying
（Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees（Central South University of Forestry and Technology），Ministry of Education，Changsha 410004）

In order to study the bioactivities of ethanol extracts from Phytolacca americana, Citrus maxima peels and Macleaya cordata against the larvaes of Dioryctria splendidella preliminarily in laboratory, contact toxicity, antifeedant activities and body weight gains of D. splendidella larvaes were determined after treated with 3 ethanol extracts. The results indicated that 3 ethanol extracts with different concentration had some bioactivities against the larvae of D. splendidella, and the higher the extracted concentrations, the more obvious of the bioactivities to the larvaes were. When the concentration of Citrus maxima peels extracts was 100 mg/mL, there were the strongest bioactivities. The contact toxicity corrected mortality, antifeedant rate and growth inhibiting rate reached to 80.00%, 99.28%, and 96.32%, respectively. The control effect in the forest was 55.70%, the same as the pesticides thiacloprid. The ethanol extracts from Phytolacca americana had the lowest bioactivities, but the corrected mortality of ethanol extracts being high concentration were more than 70%, antifeedant rates and growth inhibiting rates were more than 90%.

Ethanol extracts Dioryctria splendidella Contact toxicity Antifeedant activities Growth inhibition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.020

2014-04-21

林业公益性行业科研专项经费项目（201004014）

周洁尘，女，硕士研究生，研究方向：病虫害无公害防治技术；E-mail：244756681@qq.com

周国英，博士，教授，研究方向：森林保护及森林微生物；E-mail：guoying_zhou66@163.com