赭曲霉毒素A的微生物脱毒研究进展

贾欣 徐诗涵 梁志宏 黄昆仑

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

赭曲霉毒素A的微生物脱毒研究进展

贾欣 徐诗涵 梁志宏 黄昆仑

（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083）

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是一类聚酮化合物，是由曲霉属（Aspergillus spp.）和青霉属（Penicillium spp.）等霉菌产生的次级代谢产物，具有强烈毒性。近年来，国内外已有大量关于OTA生物脱毒的研究，主要是OTA脱毒功能菌株的筛选，包括细菌、霉菌和酵母菌等。此外，对不同微生物脱毒机理的探索也是研究热点。对上述两方面的研究进展进行归纳和讨论。

生物脱毒 赭曲霉毒素A 细菌 真菌 肠道微生物

随着人们生活水平的提高，食品安全问题日益受到重视。谷物食品是人类日常维持生命的基本物质，尤其在东方膳食体系中占据重要位置。全球大约25%的粮食作物受到霉菌毒素的污染（FAO），如黄曲霉和赭曲霉等。赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是由曲霉属（Aspergillus spp.）和青霉属（Penicillium spp.）等霉菌产生的次级代谢产物，属于聚酮类化合物，主要存在于谷物及其副产品中［1］。OTA具有强烈的肾脏毒性和肝脏毒性，并有致畸、致突变和致癌作用，对动物和人体健康有很大的潜在危害，研究OTA的脱毒对人类健康至关重要［2］。

近年来，国内外有关OTA脱毒的研究很多。OTA的脱毒方法主要有化学脱毒、物理吸附和生物脱毒，且目前比较成熟的技术主要为化学脱毒和物理吸附。但化学脱毒和物理吸附因存在副作用、费用较高、影响食品的风味和营养等原因不利于推广应用［3］。生物脱毒越来越引起人们的关注。生物脱毒是利用微生物作用去除毒素毒性，副作用小，环境友好，是一种非常理想的脱毒方法，现成为世界各国竞相研究的热点［4］。本文主要从近年来对细菌、真菌及其他一些不明确的OTA脱毒微生物的筛选和脱毒机理等方面，对OTA生物脱毒的研究进行综述。特别是肠道微生物对OTA的脱除，因其能在动物肠道发挥作用，减少体内OTA对机体的危害，因而具有更大的研究价值和应用前景。

1 细菌脱除OTA及其机理探究

目前，关于细菌脱毒的研究主要在乳杆菌（Lactobacillus spp.）、芽孢杆菌（Bacillus spp.）、短杆

菌（Brevibacterium spp.）和不动杆菌（Acinetobacter spp.）等类群中。脱除作用的主要表现是对OTA的吸附和降解，包括利用OTA作为生长繁殖的物质基础。

1.1 乳杆菌（Lactobacillus spp.）脱除OTA及其机理研究

Böhm等［5］对益生菌的OTA脱毒能力研究表明，对OTA有脱毒能力的菌种主要是乳杆菌。其中2株L-保加利亚乳杆菌（L. bulgaricus）的脱毒率分别为94%和28.5%，L-瑞士乳杆菌（L. helveticus）达到72%。由乳酸菌发酵生产的酸奶能减少OTA的含量。嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、德氏乳杆菌（L. delbrueckii）、保加利亚菌（Bulgaria bacteria）及双歧杆菌（Bifidobacterium）所发酵的酸奶中都未检出OTA，但也没有降解产物的产生。Fuchs等［6］研究了乳杆菌对OTA的脱除，证实一株嗜酸乳杆菌（L. acidophilus）对OTA有高效吸附能力，吸附率大于95%，且L. acidophilus对OTA的吸附受毒素的浓度、pH值、细胞密度和菌株生长等影响。用人的派生肝癌细胞株HepG2进行微核试验表明，该菌株能大幅度减少OTA。Del Prete等［7］将15种与酒相关的Lactobacillus spp.培养在含有OTA的液体合成培养基中，在菌株生长期间OTA减少了8%-28%，而OTA减少量的31%-57%在细胞沉淀中得到恢复，该类菌株对OTA的确具有吸附脱毒作用。

1.2 芽孢杆菌脱除OTA及其机理研究

近年来越来越多关于芽孢杆菌脱毒能力的研究，证明了芽孢杆菌具有OTA脱毒能力。Ptechkongkaew等［8］对泰国纳豆中芽孢杆菌进行研究，表明地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）具有强OTA降解能力，48 h可以将81%的OTA降解为OTα。李之佳［9］研究了Bacillus spp.对OTA的降解作用，表明2种芽孢杆菌——Bacillus sp. YB139和Bacillus sp. YB140的OTA降解率分别为48.2 %和43.4 %，2种菌的活菌均能有效降解OTA，而高温灭活菌无脱毒能力，表明这些菌株的脱毒机理为生物降解。

本实验室中，师磊等［10］进行了非致病枯草芽孢杆菌（B. subtilis）对OTA的生物控制和脱毒的研究。结果表明，Bacillus spp.能抑制赭曲霉（Aspergillus ochraceus）和炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）的生长，活菌和高温灭活菌（121℃，20 min）均能吸附OTA。此外，OTA能够被B. subtilis菌液上清降解。

1.3 其他细菌脱除OTA及其机理研究

Wegst和Lingens［11］研究了不动苯基杆菌（Phenylobacterium immobile）对OTA的脱毒能力，通过薄层色谱和高效液相色谱（HPLC）技术，分离纯化出4种降解产物，且其毒性远小于OTA。梁晓翠［12］、李之佳［9］对不动杆菌（Acinetobacter spp.）对OTA的脱毒的研究表明Acinetobacter spp.具有较强的脱毒能力，24 h内脱毒率达到80%以上，高效液相色谱检测出降解产物OTα，但灭活的菌无脱毒能力，表明Acinetobacter spp.脱毒机理为生物降解。同时对Acinetobacter spp.的脱毒特性及降解酶的性质研究表明，其降解OTA的时间曲线符合酶促反应的特征，降解速率随体系中OTA浓度的下降而逐渐减小；菌体浓度越大，脱毒能力越强。金属离子螯合剂EDTA能抑制降解酶的活性，而羧肽酶抑制剂不能抑制它的活性，说明降解酶是一种与羧肽酶A（Carboxypeptidase A，CPA）性质不同的金属酶。此外，Rodriguez等［13］对短杆菌（Brevibacterium spp.）脱除OTA的能力和机理进行研究，证实Brevibacterium spp.具有降解OTA的能力（图1）。在含高浓度OTA（40 μg/L）的BSM培养基上培养不同的 Brevibacterium spp.，所有培养基上清液中OTA完全消失且在菌和菌的清洗液中没有检测到OTA。2种Brevibacterium spp.能够完全降解高浓度（40 mg/L）的OTA生成OTα和L-苯基丙氨酸，且L-苯基丙氨酸不会进一步被短杆菌转化，表明Brevibacterium spp.具有一种酶，可能是CPA，能水解OTA的酰胺键。对上清的HPLC分析表明L-苯基丙氨酸的浓度符合假设的理论浓度。这些结果表明，OTA的酰胺键能够被CPA酶促水解，产生L-苯基丙氨酸和OTα，且没有其他有毒降解产物产生。María等［14］在2011年申请了关于Brevibacterium spp.将OTA降解为OTα的专利，证明短杆菌属具有降解OTA的能力，降解产物为OTα，且将OTA作为唯一碳源。

此外，有关根瘤菌（Rhizobium）对OTA的脱毒研究［15］表明，Rhizobium具有降解OTA的能

力，降解率可达25.1%，且降解与酶有关；溶纤维丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）在某种程度上能对OTA进行脱毒，乙酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）和苯基不动杆菌（Phenyl acinetobacter）可在液体培养基中将OTA降解为的OTα［16］。

图1 OTA的降解反应

综上所述，在对细菌OTA脱除能力的研究中，有关Lactobacillus spp.对OTA的作用机理目前还存有争议，有人认为是Lactobacillus spp.产生某种酶而引起某些代谢变化所导致的降解作用［6］，也有人认为是细胞吸附作用，但吸附的化学和分子机理仍不清楚［7］。而Bacillus spp.对OTA的脱毒作用的认识，目前多倾向于将其归为降解作用，Ptechkongkaew［8］认为是CPA对OTA的水解作用使OTA脱毒，李之佳［9］同样认为是酶的作用，但提出是不同与羧肽酶的一种金属酶，师磊等［10］却未在菌液中检测到OTA的降解产物，对于其脱毒机理有待于进一步深入研究。对上述具有脱除OTA能力的细菌进行归纳总结，见表1。

表1 脱除OTA的细菌及作用机理

2 真菌脱除OTA及其机理探究

关于真菌对OTA生物脱毒的研究较细菌透彻，主要集中在酵母和霉菌上，未见食用菌脱除OTA的报道。Varga等［17］对产虾青素的红发夫酵母（Phaffia yeast）进行了OTA的脱毒研究。在20℃下孵育15 d后，P. yeast可以降解90%以上的OTA，降解产物为OTα，且这种转变可能与CPA有关。此外，活菌和高温灭活菌能吸附大部分的OTA。但Cecchini等［18］对白酒和红酒中酵母的脱毒研究表明酵母没有降解OTA的能力。试验未检测到降解产物，在发酵过程中OTA的脱除可能是吸附作用，并且OTA可能不可恢复地吸附细胞表面。这种说法在其他试验中得到证明。如Csutorás等［19］用高浓度毒素在不同酒发酵过程中OTA浓度变化的研究，结果表明酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）能吸附90% OTA，且减少率与酒的种类有关，但差别不显著；Marco等［20］通过监测酒在发酵过程中OTA浓度的变化，同样得出Saccharomyces cerevisiae（Zymaflor VL3和VIN7）可以降低酒中OTA的浓度，吸附率在57%-79%之间。Gil-Serna等［21］对汉氏德巴利氏酵母（Debaryomyces hansenii）CYC1244对OTA的脱毒机理进行了研究。首先他们确定D. hansenii CYC1244可以抑制OTA产毒霉菌的生长和OTA的生物合成，从而提出3种脱毒机理：其一是影响OTA的生物合成；其二是OTA被吸附在酵母细胞壁或吸附进入酵母细胞内；其三是D. hansenii CYC1244降解OTA。研究表明，D. hansenii CYC 1244影响OTA的基因表达水平，当产毒霉菌与D. hansenii CYC1244共培养时OTA明显减少。进一步研究表明，OTA被D. hansenii CYC1244

细胞壁吸附更可能导致OTA减少，且pH值是影响OTA吸附的最大因素，在pH为3时吸附率最大（＞98%）；而pH为5和7时，吸附率分别为63%和65%，这表明低pH能提高D. hansenii CYC1244对毒素的吸附。D. hansenii CYC 1244对OTA无降解作用，且与孵育时间无关。即确定D. hansenii CYC 1244对OTA的作用主要为前两种机制，而OTA被吸入细胞内或被降解则没有理论依据。

综上所述，酵母对OTA的脱毒机理涉及到影响OTA的合成、降解和吸附，不同的种对OTA的作用不同，但大都倾向于是一种吸附作用［18-21］。

Bejaoui等［22］研究了黑曲霉菌（Aspergillus niger）对OTA的脱毒能力。几乎所有A.niger脱除OTA的能力在某些情况下均可达到98%-99%，A.niger能将OTA水解为OTα，在相同和不同种群间观察到的差异取决于培养基的种类。试验表明，A.niger是对OTA降解能力最大的菌种，5 d内降解率为99%。Bejaoui等［23］通过A. niger活菌和高温灭活菌的分生孢子对OTA的脱毒试验表明，A. niger的分生孢子对OTA的生物脱除是一个二级现象。第一阶段 OTA全部被A. niger的分生孢子吸附，且高温灭活的孢子也有这种能力，最后未产生OTA的降解产物。第二阶段，OTA的降解只与有活性的分生孢子有关。在含有A. niger菌丝的培养基中培养一段时间后，可检测到OTα，说明OTA发生了降解。而Stander等［24］对A. niger中的OTA降解酶进行筛选得到一种粗脂肪酶能降解OTA，可能是粗脂肪酶中的蛋白酶和酰胺酶起了降解作用，将OTA降解为OTα。研究表明CPA能水解OTA及其类似物，形成苯丙氨酸［25］。

有关A. niger对OTA的生物脱毒普遍认为是酶的作用，但在实际应用中缺乏更多的研究。如脱毒是否对原料物性有影响，若采用A. niger菌体进行脱毒应用，其产生的黑色色素是否会影响食品的正常颜色和风味等，这些问题都有待进一步的研究。

还有涉及其他真菌对OTA脱毒的研究，如Engelhardt［26］对白腐真菌（White rot fungus）的研究表明，属于White rot fungus的粗皮侧耳菌（Pleurotus ostreatus）对OTA有降解能力。在固体发酵培养基上，能将OTA水解为OTα，降解率为77.3%；de Felice等［27］对出芽短梗霉菌（Aureobasidium pullulans）、Varga等［15］对根霉菌（Rhizopus bacteria）的脱毒研究表明，出芽短梗霉菌和根霉均有OTA脱毒作用，但都没有涉及到脱毒机理的研究。对以上具有OTA脱除能力的真菌及其作用机理进行归纳总结，见表2。

表2 脱除OTA的真菌及作用机理

3 脱除OTA的肠道微生物

很多实验涉及到肠胃道微生物对OTA的脱毒能力研究，得到具有OTA降解能力的肠道菌群，这为筛选适用于粮食中的OTA脱毒菌种提供丰富资源，并且由于其本身对肠道环境的适应性，对生物肠道无危害性，更为其在粮食中的应用奠定了基础。

Varga等［16］对动物体内曲霉属真菌的脱毒研究表明，反刍动物瘤胃中的微生物可以降解OTA，人类胃肠道中也有菌种可以降解OTA。Upadhayaa等［28］对猪的肠道微生物进行了分离、筛选和鉴定，研究其对OTA的降解能力。研究表明猪的肠道菌群中分离出的一种厌氧菌对OTA有很强的降解能力。在体外固体发酵培养基上，该菌24 h后能完全降解OTA。Madhyastha等［29］对鼠肠道微生物的研究表明鼠肠道微生物可以将OTA水解为毒性较小的OTα，且大肠和盲肠是OTA水解的主要场所。Mobashar等［30］研究了瘤胃中的微生物种群对OTA降解能力和饮食对OTA降解的影响，结果表明瘤胃微生物和饮食都会影响OTA的降解。瘤胃微生物中主要是细菌有较高的降解OTA的能力，一些原生生物似乎也有一定的降解能力，而饮食对原生生物的数量有一个二次效应，从而影响到OTA的降解。Camel等［31］对人肠道微生物对OTA的降解能力的研究表明，在含OTA的培养基中培养人肠道微生物，OTA的平均

降解率为47%和34%。分离纯化得到3种降解产物，分别为OTα，OTB和OP-OTA（开环OTA）（图2）。OTα和OTB的毒性均小于OTA，但OP-OTA的毒性却大于OTA。有很多研究已证实OTα为OTA的一种降解产物，然而对于OTB和OP-OTA的报道少之又少。这项研究启示人们去研究OTA的降解途径并阻断OTA转变为OP-OTA的途径。这些将成为未来研究的热点。

图2 人的肠道微生物对OTA的降解

4 展望

粮食与饲料的真菌毒素污染问题是全球性的难题，目前利用微生物和微生物酶脱除真菌毒素与物理、化学方法脱毒相比，具有材料容易获得和扩培，环境友好，易于应用等优势，具有很好的应用前景。生物脱除OTA的各种微生物中，细菌以其数量庞大，代谢途径多样可能成为未来首选。该领域前期研究获得能够降解OTA的细菌种类也远远高于酵母菌和霉菌。目前对微生物脱除OTA的机理研究主要集中在微生物产生的蛋白类肽类和蛋白酶对OTA的作用，已有研究结果证实蛋白酶能将OTA转化为毒性很小的OTα，从而达到脱毒的目的。但目前大多数对OTA的脱毒研究局限于脱毒菌种的分离与筛选，而对脱毒菌株OTA降解酶研究得很少，在已有研究的基础上，进一步利用一定的现代分离技术，从脱毒菌株中获得高纯度的OTA降解酶，分析其蛋白结构及作用机制；找出降解酶对应的编码基因，利用基因工程手段进行高效表达，并利用酶工程手段提高酶的稳定性，制成酶制剂；或通过基因工程手段获得更高降解效率、可用于实际脱毒的高效菌株，

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（责任编辑 狄艳红）

Bio-detoxification of Ochratoxin A by Microorganism

Jia Xin Xu Shihan Liang Zhihong Huang Kunlun
（College of Food Science and Nutrition Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083）

Ochratoxin A（OTA）is a class of polyketides, which are secondary metabolites produced by Aspergillus spp. and Penicillium spp., having a strong toxicity. In recent years, there are a large number of domestic and international researches on OTA biological detoxification, mainly on screening strains of OTA detoxification, including bacteria, molds and yeasts and so on . In addition, exploring different microbial detoxification mechanism is also a research hotspot. In this paper, these two aspects of progress were summarized and discussed.

Bio-detoxification Ochratoxin A Bacterial Fungi Intestinal microbial

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.003

2014-04-13

国家高技术研究发展计划（“863”计划）（2012AA101609-7），教育部（2011JS119）

贾欣，女，硕士研究生，研究方向：微生物脱毒与食品安全；E-mail：jx610425@163.com

梁志宏，女，博士，副教授，研究方向：微生物与食品安全；E-mail：lzh01@cau.edu.cn