响应面法优化回流提取紫薯花青素工艺

刘倩 齐计英 韩静 万阅 郑士彬

（沈阳药科大学制药工程学院，沈阳 110016）

响应面法优化回流提取紫薯花青素工艺

刘倩 齐计英 韩静 万阅 郑士彬

（沈阳药科大学制药工程学院，沈阳 110016）

旨在获得紫薯花青素的最佳提取工艺，采用中心组合（Box-Behnken）试验设计及响应面分析相结合的方法，对紫薯花青素的回流提取工艺进行优化。单因素试验结果显示，最佳乙醇体积浓度为75%、提取温度为60℃、提取时间为60 min、液料比为7∶1，在此基础上，利用中心组合（Box-Behnken）试验设计及响应面分析法进行回归分析，获得最优工艺参数为：乙醇体积浓度74%、提取温度66℃、提取时间56 min、液料比8∶1。在优化后的条件下进行验证试验，得到紫薯花青素的提取率为4.64 mg/g，与理论值（4.68 mg/g）相比，相对误差较小，为0.85%。研究表明，采用响应面法分析优化紫薯花青素的水浴回流提取工艺参数准确可靠，可应用于紫薯花青素的提取生产。

紫薯 花青素 回流提取 中心组合设计 响应面分析

紫薯（purple sweet potatoes，PSP），俗称黑红薯，薯肉呈紫色至深紫色，是新近开发出的优良甘薯品种，其肉质紫红，外观诱人。其富含蛋白质、淀粉、果胶、纤维素、氨基酸、维生素及多种矿物质，同时还富含硒元素和花青素［1］。紫薯花青素是从紫薯的茎叶或块根中提取出来的一种水溶性的天然色素，它属于酚类化合物中的类黄酮类，分子量为287.246，分子式为C15H11O6，基本结构包含一个黄酮母环和一个苯环，黄酮母环上和苯环相连的碳具有手性，因此花青素具有两种同分异构体。近年的研究表明，紫薯花青素具有清除自由基、抗突变、降低高血压、减轻肝功能障碍的活性［2-4］。另外，紫薯花青素具有抗炎、抗菌、抗紫外线和减轻记忆缺陷的功能［5，6］。紫薯花青素具有纯天然效应和营养功能，应用于食品中安全性高，对人体无害，具有广阔的市场应用前景。加之紫薯具有其它作物无

可比拟的高产、稳产、适应力强等特点，因此开发紫薯花青素具有很强的原料优势，紫薯中花青素的应用研究已成为热点。

响应面法（Response surface methodology，RSM）是以多元二次回归数学模型为工具，描述相互作用的试验因子与响应值之间的关系的数据处理方法。响应面法能有效地找到因素间的最优组合，相比于传统的全因子试验设计，该法能在更为经济的试验次数下，得到精确的统计结果，具有周期短、精确度高等优点。回流提取方法相对于超声提取、微波提取和超临界提取等常用提取方法具有操作简单、溶剂用量少、设备成本低、稳定性好和易于工业化生产等优点。因此，本研究通过单因素试验和响应面法优化试验对乙醇体积浓度、提取温度、提取时间、液料比等因素对紫薯花青素提取率的影响进行研究，分析各因素的变化规律，以期获得回流法提取紫薯花青素的最佳工艺条件，为紫薯花青素的工业化生产提供基础研究，以便对紫薯资源进一步开发利用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料及试剂 紫薯：购于沈阳家乐福超市；儿茶素标准品：购于上海江莱生物科技有限公司；浓盐酸、香草醛、无水甲醇、无水乙醇、丙酮均为国产分析纯。

1.1.2 仪器 RRHP-200型万能高速万能粉碎机，欧凯莱芙（香港）有限公司；DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；旋转蒸发器RE-5299，巩义市予华仪器有限责任公司；电子天平，常熟市金羊天平仪器厂；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限责任公司；紫外可见分光光度计，北京普析通用有限公司。

1.2 方法

1.2.1 花青素含量测定 紫薯花青素的测定采用盐酸-香草醛法［7］。

1.2.2 紫薯花青素的提取工艺 将新鲜紫薯洗净，经过一定的预处理得到紫薯干粉。准确称取紫薯干粉5 g，按一定的料液比加入到一定体积浓度的乙醇溶液中，在一定温度下水浴回流提取一定的时间，真空抽滤后，滤液用真空旋转蒸发器浓缩至少于50 mL，转入50 mL容量瓶中并用相同体积浓度的提取剂定容至刻度，得到待测液。

1.2.3 紫薯预处理方式的选择 紫薯洗净，按3种方式处理后备用：（1）切片后加盐脱水、晾干至恒重、粉碎；（2）切片后晾干至恒重、粉碎；（3）切片后放入60℃烘箱中干燥至恒重，粉碎。确定3种处理方式对紫薯花青素提取率的影响。

1.2.4 最佳提取溶剂的选择 以甲醇、乙醇和丙酮为提取溶剂，确定不同提取剂对紫薯花青素提取率的影响。

1.2.5 单因素试验 分别考察乙醇体积浓度、提取时间、提取温度、液料比等因素对花青素提取率的影响。

1.2.6 响应面法试验设计 根据Box-Behnken试验设计原理［8］，综合单因素影响试验结果，以乙醇体积分数（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、液料比（D）四因素为自变量，以紫薯花青素提取率为响应值，利用Box-Behnken组合设计试验方案，并以-1，0，1分别代表变量的因素编码，变量的因素编码及水平如表1所示，进行水浴回流提取紫薯花青素条件的优化。采用Design Expert 8.0软件进行试验设计。

表1 响应面分析试验因素水平表

2 结果

2.1 标准曲线

根据所取标准品质量浓度和吸光度数据绘制标准曲线（图1），经数据处理分析获得儿茶素标准曲线回归方程为：y=6.646x+0.020，R2=0.998。

2.2 紫薯预处理方式的确定

由图2可知，直接晾干比盐脱水后晾干和烘干的花青素提取率高。因此，采用将鲜样品切片后晾

干至恒重、粉碎的方法处理紫薯，进一步用于试验。

图1 儿茶素标准曲线

图2 不同处理方法对花青素提取率的影响

2.3 提取溶剂对花青素提取率的影响

由图3可知，提取溶剂为丙酮的花青素提取率比提取溶剂为乙醇的提取率略高，提取溶剂为甲醇的花青素提取率较低。但乙醇比甲醇、丙酮毒性低，且价格也较之低。所以本试验选择用乙醇作为提取溶剂。

图3 不同提取溶剂对花青素的影响

图4 各因素对花青素提取率的影响

2.4 单因素试验结果

2.4.1 乙醇体积浓度对花青素提取率的影响 由图4-A可知，随着乙醇体积浓度的增加，紫薯花青素的提取率不断增加，但当乙醇体积浓度在75%-85%

之间时，花青素提取率没有太大变化，继续增加体积浓度比，花青素提取率明显下降。而乙醇用量过多使得生产成本提高，不利于实际生产应用。因此，最优乙醇体积浓度为75%。

2.4.2 提取温度对花青素提取率的影响 由图4-B可知，在一定范围内，随着温度的增加，紫薯花青素提取率随之升高，到60℃时达到顶峰，但继续升高温度，提取效果反而降低。因此，60℃为最优提取条件。

2.4.3 提取时间对花青素提取率的影响 由图4-C可知，在一定范围内，随着提取时间的增加，紫薯花青素提取率随之升高，到1 h时达到顶峰，而此后若继续反应，花青素提取率反而降低。因此，60 min为最优提取条件。

2.4.4 液料比对花青素提取率的影响 由图4-D可知，随着液料比的增大，紫薯花青素的提取率增加，但当液料比超过一定范围后，花青素提取率增加的不再明显。如图所示，在7∶1-15∶1之间，其花青素的提取率变化不大。出于节省原料以及高的液料比对后续的浓缩工作不便等因素的考虑，7∶1为最优液料比。

2.5 响应面法试验设计及结果

单因素试验结果显示，乙醇体积浓度为75%、提取温度为60℃、提取时间为60 min、液料比为7∶1时紫薯花青素有最大提取率。紫薯花青素提取的响应面试验设计方案与试验结果见表2。

表2 响应面分析试验设计及结果

2.6 模型方程的建立及显著性检验

根据表2结果计算各项回归系数，以这些回归系数建立紫薯花青素提取率与乙醇体积浓度（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、液料比（D）四个因素的数学回归模型。回归方程中回归系数的估计值见表3。由表2可以得出二次回归方程式为：紫薯花青素提取率＝4.63-0.072×A+0.11×B-0.035×C+0.17×D+0.034×A×B+0.024×A×C-0.029×A×D-0.046×B×C+0.040×B×D-4.750E-003×C×D-0.30×A2-0.21×B2-0.18×C2-0.27×D2在回归方程中，B、D变量的正系数表明，该变量的正向变化能引起响应值的增加；A、C变量负系数表明，该变量的正向变化能引起响应值的减少。负的二次项系数表明，方程的抛物面开口向下，具有极大值点，能够进行最优分析。

回归模型方差分析（表3）显示，试验选用的模型极显著（P＜0.000 1），失拟项不显著P=0.092 0＞0.05，说明模型是合适的；模型的校正决定系数R2

Adj=0.927 8，说明该模型能解释92.78%响应值的变化；相关系数R2=0.963 9，说明该模型拟合程度良好，预测值与实测值之间有较好的相关性，试验误差小，可以用回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测。

由表3可知模型的一次项B、D影响极显著，A影响显著，C影响不显著。从F值可以看出，单因素对提取率的影响顺序依次是D＞B＞A＞C，即液料比

＞提取温度＞乙醇体积浓度＞提取时间。交互项影响不显著，二次项A2、B2、C2、D2影响极显著，表明各影响因素对提取率的影响不是简单的线性关系。

表3 响应面回归模型的方差分析

2.7 响应面交互作用分析与工艺优化

对乙醇体积浓度（A）、提取温度（B）、提取时间（C）、液料比（D）四因子，两两作交互作用分析，对其作响应面图，分别见图5-图10。

图5 乙醇体积浓度和提取温度的响应曲面和等高线图

等高线的形状反映交互效应的强弱大小，圆形表示两因素交互作用不显著，而椭圆形则表示两因素交互作用显著。图7-图10中等高线呈椭圆形，故乙醇体积浓度和液料比两因素之间、提取温度和提取时间两因素之间、提取温度和液料比两因素之间、提取时间和料液比两因素之间交互作用显著。

在求取最优提取条件时RSM能够综合考虑各因素对2个响应值不同的影响程度及趋势进行综合评价。可得最佳工艺参数为：乙醇体积浓度74%、提取温度66℃、提取时间55 min、液料比8∶1，在此优化条件下，花青素的提取率的理论值为4.68 mg/g。为了进一步验证响应面分析法的可靠性，采用上述最优条件进行花青素提取，重复3次，测得紫薯花青素提取率分别为：4.64、4.65和4.64 mg/g，取平均值为4.64 mg/g，与理论值相比，相对误差较小，为0.85%。因此，采用响应面法分析优化得到的紫薯花青素水浴回流提取的参数准确可靠，可用于实际操作。

3 讨论

本研究首先确定了紫薯的预处理方式和提取溶剂的选择，以花青素提取率为指标，对提取过程中影响花青素提取的乙醇体积浓度、提取温度、提取时间和液料比4个因素，首先进行单因素试验考察，再采用中心组合（Box-Behnken）试验设计及响应面分析，建立回归模型。通过分析各因素的显著性和交互作用，优化得到紫薯花青素回流提取的最优工艺参数。

紫薯预处理方式的确定试验结果显示，直接晾干比盐脱水后晾干和烘干的花青素提取率高。出现这种情况的原因可能是花青素存在于细胞的液泡中，

可能在盐脱水过程中破坏了细胞，使花青素溶出细胞外，在空气中氧化，而导致含量降低；加热会部分破坏花青素，并且烘干消耗大量的热能，成本较高。在提取溶剂的选择试验中，提取溶剂为丙酮的花青素提取率比提取溶剂为乙醇的提取率略高，提取溶剂为甲醇的花青素提取率较低。实际生产中，用乙醇代替了许多常用的溶剂，如甲醇、丙酮、乙醚，因为这些试剂有毒性，不利于粗提取物在食品和药品中的进一步利用［9］，另外，乙醇能以任意比例与水互溶，能有效溶解花青素，提取液易于保存，过滤、回收和安全性也比较高，溶剂残留现象不突出。所以本试验中乙醇可作为提取溶剂的最佳选择。

图7 乙醇体积浓度和液料比的响应曲面和等高线图

图8 提取温度和提取时间的响应曲面和等高线图

单因素试验中，乙醇体积浓度、提取温度和提取时间的变化趋势，提取率先升高然后下降。温度

的升高，有利于增加乙醇的渗透能力，致使溶剂化的花青素从细胞内向外的扩散能力也增加，使得提取率升高；继续提高温度，紫薯花青素会发生热降解，其结构向查耳酮转变，导致有色结构2-苯并吡喃盐和醌式假碱减少［10］，提取率降低。在一定时间内，花青素随时间的延长而不断被溶解出，提取时间愈长，提取率越高，但扩散达到平衡后，细胞内外浓度达到动态平衡，故随着时间再延长提取率无明显变化；时间过长，由于花青素在加温溶液中稳定性可能随时间变化，因此提取时间的继续延长，花青素因氧化分解反而使含量降低［11］，因此，提取率降低。随着液料比的增大，紫薯花青素的提取率增加，但当液料比超过一定范围后，花青素提取率增加的不再明显。这是因为对于一定量的紫薯粉末来说，溶剂用量的增加降低了溶剂中花青素的浓度，增加了原料与溶剂接触界面的浓度差，从而提高了花青素与溶剂的扩散速度，提取率增大；但是当达到一定比例时，溶液中花青素的浓度达到平衡浓度，提取率就不再升高，甚至可能会减少，因为溶剂用量过大，颗粒细胞内的蛋白质等物质析出，反而不利于花青素的溶出，从而造成提取率的下降。

图9 提取温度和液料比的响应曲面和等高线图

图10 提取时间和液料比的响应曲面和等高线图

4 结论

采用Box-Behnken的中心组合设计及响应面（RSM）分析，建立紫薯花青素色素提取的二次多项式数学模型。经检验证明该模型是合理可靠的，能够较好地预测薯花青素提取率。利用模型的响应面及其等高线，对影响薯花青素提取率的关键因素及其相互作用进行探讨，通过典型分析并考虑到实际操作的便利性得到的最终优化工艺参数为乙醇体积浓度74%、提取温度66℃、提取时间55 min、液料比8∶1，在此优化条件下，花青素的提取率的理论值为4.68 mg/g。为了进一步验证响应面分析法的可靠性，采用上述最优条件进行花青素提取，重复3次，测得紫薯花青素提取率分别为：4.64、4.65和4.64 mg/g，取平均值为4.64 mg/g，与理论值相比，相对误差较小，为0.85%。因此，采用响应面法分

析优化得到的紫薯花青素水浴回流提取的参数准确可靠，可用于实际操作，能有效减少工艺操作的盲目性。

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（责任编辑 马鑫）

Optimization of Refluxing Extraction Technology of Anthocyanins from Purple Sweet Potato by Response Surface Method

Liu Qian Qi Jiying Han Jing Wan Yue Zheng Shibin
（School of Pharmaceutical Engineering，Shenyang Pharmaceutical University，Shenyang 110016）

Response surface methodology（RSM）was used to optimize the refluxing extraction process of anthocyanins from purple sweet potatoes as a result of getting the optimum technology. The results of single-factor test showed that the best ethanol concentration was 70%, extraction temperature was 60℃, extraction time was 60 min, liquid-material ratio was 7∶1. Based on these results, the significant parameters were further optimized using Box-Behnken design, RSM and regression analysis. The optimum parameters were：ethanol concentration 74%, extraction temperature 66℃, extraction time 56 min, liquid-material ratio 8∶1. Under such conditions, the extraction efficiency could reach 4.64 mg/g, and have a smaller relative error at 0.85% compared with the theoretical value（4.68 mg/g）. The study showed that the processing parameters achieved from these experiments were accurate and can be applied to the extraction and production of anthocyanins from purple sweet potatoes.

Purple sweet potatoes Anthocyanin Refluxing extraction central Composite design Response surface methodology

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2014.12.016

2014-05-12

刘倩，女，硕士，研究方向：天然活性物质的提取与制剂研究；E-mail：18604019826@163.com

韩静，女，博士，研究方向：天然活性物质分离提取应用研究，纳米技术制药与工程研究；E-mail：HJ-8080@163.com